实验报告朱正荣..docVIP

关于碱性磷酸酶的分离纯化与性质研究 生物技术1101班 朱正荣 201131301024 摘要： 为了掌握酶分离纯化的一般步骤及相关原理，熟悉碱性磷酸酶的分离纯化的方法步骤。学会碱性磷酸酶动力学——Km测定方法，掌握碱性磷酸酶最适pH值及酸碱稳定性范围的测定方法。掌握碱性磷酸酶的最适温度及热稳定性范围的测定方法。了解碱性磷酸酶的抑制剂类型。 关键词：碱性磷酸酶；分离纯化；酶工程学 碱性磷酸酶（ ALP 或 AKP ）是广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶。这种酶能催化核酸分子脱掉5’磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5’-P末端转换成5’-OH末端。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。目前已发现有 AKP1 、 AKP2 、 AKP3 、 AKP4 、 AKP5 与 AKP6 六种同功酶。其中第 1 、 2 、 6 种均来自肝脏。 碱性磷酸酶是一种底物专一性较低的磷酸单酯酶，广泛存在于人体、动物、植物与微生物中，在生物体内发挥了重要作用[1]。它在脊椎动物的骨化过程中发挥了重要作用[1]。提纯的碱性磷酸酶可用于核酸研究、毒物学研究及医学研究[2]。由于有益于皮肤细胞的再生和新陈代谢，该酶还可添加到药用化妆品中[3]。本文在前人工作的基础上尝试了猪肝碱性磷酸酶的分离纯化，并对其性质进行了探讨。本实验采用有机溶剂沉淀法从肝匀浆中分离纯化碱性磷酸酶。分离纯化碱性磷酸酶后，控制温度和PH及酶浓度恒定的条件下。用Km测定方法测定酶促反应的速度。酶的生物学特征之一就是它们对酸碱度的敏感性，这表现在酶的活性和稳定性易受环境PH的影响。PH对对酶的活性影响极为显著，通常各种酶只有在一定的范围内才表现出活性，同一种酶在不同的PH条件下所表现的活性不同，其表现活性最高的PH值称为酶的最适PH。PH除了对酶的解离状态产生影响外，还可能影响底物的解离和影响反应系统中其他组成成分的解离。PH不仅对酶的活性有很大的影响，而且对酶的稳定性也有很大的影响。因为该酶的化学本质是蛋白质，统蛋白质变性一样，酶在过酸或过碱的条件下也很容易变性失活。对温度的敏感性是酶的又一个重要特性。温度对酶的作用具有双重的影响，一方面与一般的化学反应一样，温度加速酶的反应速度，另一方面该酶是蛋白质，温度加速酶蛋白的变性速度。因此，在较低的温度范围内，酶反应的速度随温度的升高而增大，但超过一定温度后，反应速度反而下降。酶反应速度达到最大值是时的温度的温度称为酶反应的最适温度。由于酶受热后易变性失活，因此各种酶对热都有一个稳定的范围。酶的种类和来源不同，对热的稳定性也不同，就需要通过热稳定性实验测出热稳定范围。抑制剂是引起酶促反应速度降低的一类物质的统称，它与酶的活性部位结合，改变了没活性部位的结构或性质，从而引起酶活力的下降，这里不包括酶蛋白的水解或变性等情况。 1 材料和方法 1.1材料 1.1.1实验材料 新鲜猪肝匀浆 1.1.2实验试剂 0.5mol/l醋酸镁溶液：107.25g醋酸镁溶于蒸馏水中，定容至1000ml 0.1mol/l醋酸钠溶液：8.2g醋酸钠溶于蒸馏水中，定容至1000ml 0.01mol/l醋酸镁-0.01mol/l醋酸钠溶液：准确吸取20ml 0.5mol/l醋酸镁溶液及100ml 0.14mol/l醋酸钠溶液，混匀后定容至1000ml Tris-HCLpH8.8缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷12.1g，用蒸馏水溶解后定容至1000ml，即为0.1mol/lTrls溶液。取100ml 0.1mol/lTrls溶液，加蒸馏水约780ml，再加0.1mol/l醋酸镁溶液100ml，混匀后用1%冰醋酸调pH为8.8，用蒸馏水定容至1000ml。 正丁醇；丙醇；95%乙醇 0.04mol/l作用物液：称取10.16g磷酸苯二钠，用煮沸后冷却的蒸馏水溶解，并稀释至1000ml，加4ml氯仿防腐，贮于棕色瓶内 0.1mol碳酸盐缓冲液（pH10.0）：称取无水碳酸钠6.36g及碳酸氢钠3.36g，溶于蒸馏水中，并稀释至1000ml 碱性磷酸酶液 0.5mol/lNaOH溶液 0.3%4-氨基安替比林：称取3g4-氨基安替比林及碳酸氢钠42g，用蒸馏水溶解，并稀释至1000ml，贮于棕色瓶中 0.5%铁氰化钾：称取10g铁氰化钾及30g硼酸各溶于800ml蒸馏水中，溶解后两液混合加水至2000ml，贮于棕色瓶中。 基质液：称取磷酸苯二钠·2H2O 6g，4-氨基安替比林3g，分别溶于煮沸冷却后的蒸馏水中，两液混合并稀释至1000ml，加4ml氯仿防腐，贮于棕色瓶中。 各pH值相应缓冲液： 0.2M甘氨酸称取15.01g溶于水定容至1000ml 0.2NNaOH 按下表配成相应pH值得缓冲液