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微生物的实验室培养 一、基础知识 细菌的营养类型 根据细菌所利用的能源和碳源的不同，将细菌分为两大营养类型。 自养菌（autotroph） 异养菌（heterotroph） 腐生菌 寄生菌 大部分病原菌 选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。 2.培养基内所含的基本物质 (1)水 (2) 碳源 (3)氮源 (4)无机盐 3.培养基内所需的其他条件 (1)pH值 如:培养霉菌需酸性、培养细菌需中性或微碱性 (2)特殊营养物质 如：培养乳酸杆菌需要在培养基中添加维生素 (3)氧气的含量 如:培养厌氧微生物时需要提供无氧的条件 (二)无菌技术 1、获得纯净培养物的关键: 2、无菌技术包括的四个方面(自学) 3、消毒与灭菌 (1)消毒： 概念：使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。 方法: 煮沸消毒法 巴氏消毒法：如牛奶的消毒 化学药剂消毒：酒精、氯气、石碳酸、煤酚皂溶液等 紫外线消毒 （2）灭菌 概念：使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。 方法：a 灼烧灭菌 b 干热灭菌 c 高压蒸汽灭菌 平板划线时不能划破培养基，为什么？ 一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的； 二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。 涂布平板操作 讨论3：涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想想，第2步应如何进行无菌操作？ 本课题知识小结 （1）原理：尿素是一种重要的农业氮肥，只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨之后，才能被植物利用。尿素细菌能合成脲酶，在脲酶的作用下尿素被分解成氨。 CO(NH2)2+H2O CO2+2NH3 （2）实验设计的内容包括实验方案、材料用具、实施步骤和时间安排等。 （3）实验流程： 土壤取样 样品系列稀释 涂布平板与培养 观察并记录结果 启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 原理—高温淘汰其他菌，选出耐高温细菌，耐高温菌种提取耐高温酶。 2、实验室中微生物的筛选原理： 人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。 什么是选择性培养基？ 允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。 15.0g 琼脂 1.0g 尿素 10.0g 葡萄糖 0.2g MgSO4`7H2O 2.1g NaH2PO4 1.4g KH2PO4 3、本课题所使用培养基： ①从物理性质看此培养基属于哪类？ 固体培养基 ②该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？ ③此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？ 碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素 能。只有产生脲酶的细菌才能利用尿素作为氮源而生存。 1、显微镜直接计数： 利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。由于此法计得的是活菌和死菌的总和，又称总菌计数法。 ㈡.统计菌落数目： 不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察； 不能做出较为宏观、全面的反映 缺点： 优点：直观、快速 设备简单、能观察微生物的形态特征 2.间接计数法（活菌计数法） ⑴原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。 ⑵常用方法：稀释涂布平板法 注意事项 ①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30—300的平板上进行计数。 ②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的培养皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。 ③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。 设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。 ㈢.设置对照： 三、实验设计 菌落计数 ◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。 ◆为了提高效率，在操作时更加有条不紊