(首先了解样品的性质.pptVIP

7.在纯化过程中酶活力的损失主要原因：蛋白质变性 避免方法：改变温度和pH 其他原因：辅助因子被去除 酶分离纯化的方案设计 a. Sketch the elution profile expected if this mixture is run on a Sephadex G-100 gel filtration column run in 50 mM phosphate buffer, pH 6. Label the peaks. b. Sketch the gel obtained from running these proteins on an SDS polyacrylamide electrophoresis gel at pH 8.0, (after staining and destaining). c. What predictions can you make about the results of a native PAGE at pH 7.6 ( state any assumptions you might need to make about the % acrylamide in the gel ) d. Sketch the elution profile of these proteins from a carboxymethyl cellulose ion exchange chromatography column, run at pH 6.25 (with a salt gradient, if necessary). Label the peaks. 第七节 蛋白质浓度的测定  凯氏定氮法 双缩脲法 福林（Folin)-酚试剂法 考马斯蓝染色法 紫外光吸收法 Determination of enzyme activity Enzyme activity （酶活力，酶活性） Active unit（酶的活力单位） Specific activity（酶的比活力） Enzyme activity 定义指酶催化一定化学反应的能力用在一定条件下，酶所催化的某一化学反应速度（初速度）来表示 方法测定产物增加的量或底物减少的量eg. 化学滴定、比色、测定紫外吸收、荧光测定 Active unit （U） 国际单位1个酶活力单位，是指在特定条件下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。特定条件：温度—25oC 其他条件（eg. pH及底物浓度）均采用最适条件。 习惯用法eg. ?-淀粉酶，用每小时催化1g可溶性淀粉液化所需要的酶量来表示。 实例 ?-淀粉酶，?-淀粉酶 果胶酶 蛋白酶 脂酶 过氧化物酶 (POD) 多酚氧化酶 (PPO) 脂肪氧合酶  ?-淀粉酶活力测定方法碘显色能力下降的速度底物粘度下降速度糖苷键被打断的速度 ?-淀粉酶活力的测定方法麦芽糖形成的速度3，5-二硝基水杨酸、铁氰化钾或碱性铜盐溶液测定还原基团形成的速度 果胶酶活力的测定 PE (pectin esterase果胶酯酶)： 滴定法(pH-stat法) PG (polygalacturonase聚半乳糖醛酸酶)和PMG (polymethylgalacturonase聚甲基半乳糖醛酸酶)（为内切酶时）：粘度法 PMGL （polymethylgalaturomide lyase聚甲基半乳糖醛酸裂解酶） PGL（ polygalacturonmide lyase聚半乳糖醛酸裂解酶）：降解产物的C4和C5之间形成双键，在235nm处有吸收。 蛋白酶活力的测定 原理： 根据蛋白质经酶作用后在一定浓度的三氯醋酸（TCA）溶液中溶解度的变化来确定酶的活力。 肽的含量测定： 紫外分光光度法 显色法（茚三酮、双缩脲试剂、福林酚试剂） 底物：0.5%酪蛋白 缓冲溶液：0.02M，pH7.5PB 酶液配制：精确取定量的酶粉100mg，加少量缓冲液研磨，定容100ml，离心，取上清液10ml定容100ml。 酶活力测定：酶和底物分别于30℃水浴保温，取出2ml底物加入稀释的酶液1ml，立即混匀计时，反应15min，立即加入3ml 10%TCA终止，室温静置半小时，过滤，取1ml滤液用Folin-phenol法测定可溶性蛋白质，680nm比色。 酶活力定义：在30℃pH7.5条件下，每分钟水解酪蛋白产生1?g酪氨酸的酶量为一个酶活力单位。目前国内工厂都以1g酶制剂所含的酶活力单位数来表示酶制剂的活力。 酶活力单位=6/15?K?O.D?n 脂酶活力的测定 底物：不溶解的