脑干热休克蛋白70的表达与实验性脑损伤猝死的相关性..doc

脑干热休克蛋白70的表达与实验性脑损伤猝死的相关性 摘要：目的??了解脑损伤后热休克蛋白70 (Heat-shock protein 70, HSP70) 蛋白质及mRNA在脑干局部的改变，及其对维持脑干生命中枢功能的作用。方法??用头颅打击器制成大鼠脑损伤猝死模型，免疫组化法分别测定损伤组损伤前和损伤后1、3、6、12 h及损伤猝死组脑干HSP70的数量和分布变化；逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测各组相应部位HSP70 mRNA水平。 结果??在脑损伤15 min后脑干HSP70 mRNA水平显著升高， HSP70蛋白质需3~6 h才大量表达；损伤后猝死的鼠脑中仅见HSP70 mRNA升高，HSP70蛋白质与对照组无差异。结论??脑损伤后HSP70合成迅速增加，清除损伤因素，维持自稳状态；当损伤严重时，应激蛋白质的合成障碍，抗损伤的保护机制不能发挥，脑干生命中枢的功能紊乱，生命丧失。因此， HSP70 mRNA-蛋白质分离可作为神经细胞致死性损伤的标志。 关键词： 热休克蛋白类； 脑损伤； 免疫组织化学； 多聚酶链式反应 相关帮助 需要相关抗体试剂的可以访问Fantibody全球抗体搜索引擎 fantibody全球抗体搜索引擎是一个供公共检索的抗体数据库，其抗体信息数据来源于全球范围的研究机构与商业公司。该引擎由商品化抗体数据库与抗体应用评价数据库两部分组成，以帮助研究者更高效的寻找并评估该抗体的性能。全球抗体搜索引擎是继基因与蛋白数据库之后更为复杂的应用型检索平台 需要相关的实验室仪器设备、生物试剂、医疗器械、制药设备、医药原料、体外诊断试剂及耗材与技术服务信息的，可以访问探生网biomean进行咨询，期待您的加入 脑损伤致死的机制涉及脑外伤危重程度的判定、抢救措施的实施及法医鉴定等。一般认为脑死亡的原因是位于脑干的生命中枢的生理活动停止。因脑干体积较小，损伤多不易发现，故何种程度的损伤为致死性损伤无确切标准。热休克蛋白(Heat-shock proteins, HSPs)作为应激反应的重要物质基础和标志，脑损伤后其表达增强已有报道[1~3]。作者发现脑干针刺损伤后，局部神经元中HSP70表达增强对于脑干开放性机械损伤具有定位价值。闭合性脑损伤时HSP70在脑干表达又如何，与生存是否相关？本研究通过观察脑损伤后大鼠脑干HSP70的表达与预后的关系，探讨致死性脑损伤的机制。???? 1??材料与方法 ????1.1??实验动物????健康Wistar大鼠45 只，体质量180~250 g，雌雄不拘。????1.2??试剂????鼠抗鼠骨髓瘤 HSP70 抗体(Santa Cruz 公司)、HIGH-SABC免疫组化染色试剂盒 (武汉博士德公司)、DAB显色试剂盒(武汉博士德公司)、RNAgents Total RNA Isolation System(Promiga公司)、OligoDT (15)(Promiga公司)、逆转录酶M-MuLv Reverse Transcriptase(New England公司)、Taq酶(基因公司)PhIX174 DNA /Hea Ⅲ Markers(Promiga公司)。????参考文献[5][6]，根据引物设计原则，确定HSP70、β-actin PCR扩增引物：5-CTCGTGCGTGGCCGTGTTCC-3，5-TCGCCCTTGTAGTTCACCTG-3 (285 b p)； 5-ACTCCTACGTGGGCGACGAG-3，5-AGGTCCAGACGCAGGATGGC-3(388 bp)(Sangon公司)。????1.3??实验方法????1.3.1??动物模型?? 大鼠吸入乙醚麻醉，剪去枕部的毛，伏卧固定在自制的大鼠颅脑弹射打击装置上，打击锤与枕骨结节相对。拉动手柄，压缩弹簧，使击锤回退，读取击杆上弹簧压缩的距离(△X)，松开手柄，击锤借弹簧推动打在枕骨结节上。该处颅骨较厚，承受打击时不易骨折，且下方是小脑延髓，易造成延髓桥脑损伤。根据虎克定律计算出鼠脑受到的打击力。将大鼠分3组：第1组为正常对照组(5只)，大鼠麻醉后直接处死；第2组为损伤组(5×6只)，打击时弹簧的ΔX为5~8 cm，打击力1.02～2.61 kN；第3组为损伤猝死组(10 只)，ΔX为9~12 cm，打击力3.31~5.88 kN。????1.3.2??取材??打击后按预定时间剪大鼠心脏处死，取脑。福尔马林固定延髓，石蜡包埋，其余脑干称重。采用Promiga公司的RNAgents Total RNA Isolation System抽提总RNA。????1.3.3??HE及HIGH-SABC免疫组化染色??取延髓冠状面切出5 μm的组织切片。常规HE染色，免疫组化染色按试剂盒