无溶剂体系中蛋白酶催化氨基酸糖酯合成研究..doc

无溶剂体系中蛋白酶催化氨基酸糖酯合成研究 黄成红 马林* 中山大学化学与化工学院，有机化学研究所，广州，510275 摘要 在无溶剂体系中，α－糜蛋白酶催化N-叔丁氧酰基-L-苯丙氨酸乙酯与D-葡萄糖进行酯交换反应，结果表明是在6位伯羟基(6-OH)进行定位酰化。生成的氨基酸葡萄糖酯可通过HPLC-UV定性并定量检测,最适条件下的反应转化率达到90%以上。 关键词 蛋白酶，无溶剂体系，α－糜蛋白酶，苯丙氨酸，葡萄糖 1 前言 糖类是自然界广泛存在的一大类生物活性分子。近年来糖科学的发展，揭示了糖类在生命过程中起着重要作用，参与了许多生理和病理现象。在细胞表面的大量受体分子几乎都是糖蛋白或糖酯类糖链化合物，对生物信息的传递作用起着重要作用[1]。 糖酯作为一种生物功能分子和化工原料具有重要价值,可用于医药、食品及高分子材料，具有其他单体无可比拟的优越性。已经合成并应用的糖酯多是高级脂肪酸糖酯、芳香酸糖酯，而氨基酸糖酯，除了甘糖酯已较为广泛的应用于医药外，其他还不多见报道。氨基酸及多肽作为另一大类生物活性分子，具有多种生理功能。我们试图将氨基酸及多肽的官能团引入糖类化合物，形成一类具有多种生理机能的氨基酸糖酯化合物。 但是氨基酸和多肽的化学合成，由于需要保护与脱保护，合成比较困难，为此Cerovsky等人用有机相酶催化反应，进行氨基酸糖酯合成的研究，反应转化率达到20-60%，并表明产物主要是6位氨基酸糖酯[2]。糖是极性化合物，需要选择强极性溶剂如吡啶、DMF等(或者将糖形成糖苷或其他衍生物以增加它在有机溶剂中溶解性) [3,4],而酶是水溶性的,不溶于有机溶剂,这就给有机溶剂中酶催化反应带来许多困难，而无溶剂条件下或超饱和体系中酶催化可以解决这些问题。 为此我们用蛋白水解酶进行氨基酸糖酯的合成研究。α－糜蛋白酶是一种研究比较多的酶，有较好的催化活性，它能催化水解L型芳香族氨基酸(如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)所组成的肽键、酰胺键和酯键[5]。用α－糜蛋白酶直接催化苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸与葡萄糖进行酯化反应,之后先将苯丙氨酸形成酯,再与葡萄糖进行酯交换反应，反应式如下（scheme1）： Scheme1 N-叔丁氧酰基-L-苯丙氨酸乙酯与葡萄糖的酯交换反应 2 实验 2.1 仪器和材料 78-1磁力加热搅拌器仪器，GKC-11R1型可控恒温水浴锅，SHZ-D循环水式真空泵，ZF-Z型三用紫外仪，HP1100型高效液相色仪，DAD检测器。 N-叔丁氧酰基－L-酪氨酸、N-叔丁氧酰基-L-赖氨酸、N-叔丁氧酰基-L-苯丙氨酸均购于Sigma, Aldrich公司，蛋白酶购于日本化成工业株式会社，α-糜蛋白酶、胃蛋白酶DMAP和DCCI均为国产，其它试剂均为分析纯，购于广州化学试剂厂。 2.2 实验方法 2.2.1 蛋白酶催化氨基酸与葡萄糖的酯化反应 将3种氨基酸：N-叔丁氧酰基－L-酪氨酸、N-叔丁氧酰基-L-赖氨酸、N-叔丁氧酰基-L-苯丙氨酸与3种蛋白酶：α-糜蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶适量交叉混合于9支小试管中，再加入葡萄糖和一定pH值的K2HPO4/KH2PO4缓冲溶液10μl，搅拌均匀。和底物空白、酶空白一起密封置于45℃水浴中反应8天。取出用乙酸乙酯萃取后进行HPLC-UV检测。 2.2.2 N-叔丁氧酰基-L-苯丙氨酸乙酯的合成[6] 按文献用DMAP和DCCI在二氯甲烷中催化脱水合成，产物用乙酸乙酯萃取并用饱和NaHCO3溶液洗涤有机层，以无水Na2SO4干燥，有机溶剂在真空下抽干,得白色油状物。 2.2.3 α-糜蛋白酶催化N-叔丁氧酰基-L-苯丙氨酸乙酯与葡萄糖的酯交换反应 分别称取N-叔丁氧酰基-L-苯丙氨酸乙酯(25μmol)与硅藻土的混合物21.9mg和葡萄糖(0mg-9.9mg)于小试管, 再分别加入α-糜蛋白酶(0-10mg)和一定pH值的K2HPO4/KH2PO4缓冲溶液(0μl-20.0μl)于小试管中，搅拌均匀。和底物空白一起密封置于45℃水浴中反应60-90小时。取出用乙酸乙酯萃取后进行HPLC-UV检测。 3 结果与讨论 3.1 蛋白酶催化氨基酸与葡萄糖的酯化反应 氨基酸直接与葡萄糖在蛋白酶催化下进行酯化，反应效果不好。相比之下，α-糜蛋白酶在生理活性的pH值下催化效果比较好。胃蛋白酶在pH=1.5-2的酸性环境中催化活性会比较好。3种氨基酸的反应性没有明显差别，基本上都没有产物氨基酸糖酯，仅α-糜蛋白酶催化的苯丙氨酸有极少量酯生成。 3.2 α-糜蛋白酶催化N-叔丁氧酰基-L-苯丙氨酸乙酯与葡萄糖的酯交换反应 鉴于无溶剂体系中α-糜蛋白酶催化N-叔丁氧酰基-L-苯丙氨酸与葡萄糖的酯化反应效果较差，为此，我们合成了N-叔丁氧酰基-L-苯丙氨酸