05 基因组序列的诠释.ppt

* Kozak共有序列ACCAUGG * SMART原则（S=Specific、M=Measurable、A=Attainable、R=Relevant、T=Time-based） 　所谓SMART原则，即是： 　　1. 目标必须是具体的（Specific） 　　2. 目标必须是可以衡量的（Measurable） 　　3. 目标必须是可以达到的（Attainable） 　　4. 目标必须和其他目标具有相关性（Relevant） 　　5. 目标必须具有明确的截止期限（Time-based） * 　cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5和3’末端的有效方法，以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。 * * Digest the double stranded cDNA with a sequence-specific restriction enzyme (an anchoring enzyme) that cleaves most transcripts at least once. Nla III is used as an anchoring enzyme since Nla III sites are known to occur approximately every 250 bp. 5. Cleave with Mme I, a Type IIS restriction enzyme (tagging enzyme). Mme I binds to a recognition sequence in the adapter adjacent to the CATG site and cleaves the cDNA ～21 bp downstream from the adapter, releasing a ~60-bp tag with a 2-bp overhang. The tag consists of ~40 bp of adapter sequence and ～21 bp of unique sequence from a single transcript. 反义RNA 作用机理： A 干扰翻译的起始与延伸，可与翻译起始顺序及编码序列结合形成双链RNA，随之被细胞降解。 B 与mRNA 的引导顺序结合，阻止核糖体的附着，使翻译无法启动。 C 反义RNA与mRNA形成双链分子后，使RNA多聚酶脱离模板,转录终止。 * 4.4 RNAi干扰 RNAi干扰是通过双链RNA的介导,特异性地降解相应序列的mRNA,从而阻断相应基因表达的转录后水平的基因沉默机制. * RNAi 作用机理 A dsRNA核酸内切酶Dicer被激活,它把dsRNA加工成21-25个核苷酸长的RNA链; B 这些小片段RNA(siRNA)作为另一个核糖核酸复合体RISC(RNA-induce silencing complex,RNA诱导沉默复合体)的指引物,结合到RISC上,使之识别并降解mRNA,从而导致与双链RNA同源的基因沉默; * * RNAi设计方法及应用 A Fraser 合成与开放读码框相对应的双链RNA或利用细菌克隆表达这些双链RNA→微量注射/喂食→干扰同源基因的表达 B Chuang 等设计出嵌合体结构 → 连接强启动子大量表达双链mRNA→干扰同源基因的表达 * * HbF基因的RNAi载体构建 RNAi技术的优缺点 RNAi最根本的特点是特异性 RNAi具有特殊的穿越能力,如将双链RNA注射在线虫性腺里,它也会干扰到体细胞里的基因表达,而且干扰作用会传给后代; 对一些低水平表达的基因，RNAi现象并不明显 RNAi能同时作用于几个有相同或相似序列的基因 * 4.5 酵母双杂交（yeast two-hybridization） 原理： 其原理涉及转录因子与启动子之间的互作。转录因子 （包括两个功能区域）→ 结合功能域同基因上游的区段结合 → 激活功能域激活RNA多聚酶 → 将基因转录为mRNA * 酵母杂交系统中： 融合表达载体1 融合表达载体2 * DNA结合功能域 +目的片段 激活功能域+ 多种未知cDNA 融合表达载体1 同一细胞 融合表达载体2 形成聚合物，启动报告基因的表达 表达载体共转化 * 5.3 从基因组到细胞 转录本组transcriptome DNA芯片分析 SAGE