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菌体生长速率对质粒拷贝数和质粒稳定性有一影响：高生长速率时质粒拷贝数下降，但稳定性增加。 质粒稳定性的分析方法 样品 （2）细胞破碎 工程菌高效表达的产物大部分在胞浆内； 细胞壁以肽聚糖为骨架，由乙酰葡萄胺和乙酰胞壁酸交替排列，形成有一定韧性的网状结构。 机械破碎方法 超声波法 在15—25千赫(kHz)的频率下操作； 操作时易引起温度上升，需要对细胞悬液做冷却处理； 大规模操作 ，因需要输入很高能量，提供必要的冷却而难于实用； 适用于破碎少量细胞，尤其是破碎包涵体表达的细胞。 高压匀浆法： 细胞悬液在高压匀浆器中受瞬间失压和高速流动形成的剪切、碰撞的作用，使细胞壁破裂； 大规模破碎细胞的常用方法。 高速珠磨法： 细胞悬液和助磨剂在高速珠磨机中被快速搅拌研磨，经剪切、碰撞，促使细胞壁破裂； 大规模破碎细胞的常用方法。 非机械破碎方法 酶解法：常用溶菌酶等破坏细胞壁 酶价格昂贵 、纯化过程中需除尽； 不适于大规模生产。 渗透压冲击法 适于细胞壁较脆弱或用酶预处理的菌体； 适用于分离周质空间分泌表达的基因工程产物。 反复冻融法 破碎率低； 引起对冻融敏感的蛋白质变性。 化学裂解法 用有机溶剂（苯、甲苯）和表面活性剂(SDS等)、抗生素、变性剂等改变细胞壁或细胞膜的通透性； 应防止目的产物变性。 选择合适的破碎方法，需要考虑 1、细胞数量； 2、产物对破碎条件(温度、化学试剂、酶等)的敏感性； 3、需要破碎程度和破碎速度； 4、尽可能采用温和的方法。 （3）固液分离 离心分离 膜分离 双水相萃取 常用的双水相系统为PEG/无机盐和PEG／葡聚糖两种。 上相（PEG富集相）含有目的蛋白(也可能含较多杂蛋白)，下相含细胞碎片、核酸、多糖等。 4、溶解氧的影响 溶解氧是工程菌发酵培养过程中影响菌体代谢的一个重要参数，对菌体的生长和产物的生成影响很大。 外源基因的高效表达和翻译需要维持较高水平的DO2值。 通常采用调节搅拌转速的方法，可以改善培养过程中的氧供给，提高活菌产量。 ⒌ 诱导时机的影响 对于λPL启动子型的工程菌，使用cI阻遏蛋白的温度敏感型突变株（cIts857），在28～30 ℃下培养时，该突变体能合成有活性的阻遏蛋白阻遏PL启动子的转录。 当温度升高42℃时，该阻遏蛋白失活，使启动子启动转录，提高目的基因的表达效率。 一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表达。 ⒍ pH的影响 pH对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有影响，所以应根据工程菌的生长和代谢情况，对pH进行适当的调节。 如采取两段培养工艺，培养前期重点是优化工程菌的生长条件，其最佳pH在6.8～7.4左右；培养后期重点是优化外源蛋白的表达条件,其最佳pH为6.0～6.5。 总之，工程菌发酵工艺的优化对异源蛋白的表达关系重大，必须建立最佳化工艺。获得最快周期、最高产量、最好质量、最低消耗、最大安全性、最周全的废物处理效果、最佳速度和最低失败率等。 α2a- IFN基因工程菌 发酵工艺的研究 批式培养方法：工程菌在进入对数期不久，即进入减速期，随后进入稳定期，此时菌体的浓度不高，菌体抑制物的积累也不多，还有充足的生长空间。如果有充足的营养物质和溶解氧，工程菌还会继续旺盛生长。 流加式培养方法：即在菌体进入减速期前，新的营养物质不断补充，使得工程菌始终处于最优环境，延长了稳定期，也就是延长了对数期。 流加培养基的组成和配比，不仅要满足工程菌生长代谢所需，还要有利于目的产物的表达。在补加营养时，速度不宜过快，否则溶氧量很快降低，会产生一些杂蛋白，因此在流加过程中要不断提高搅拌转速和通气量，来维持溶氧稳定。 工程菌生长和IFN活性关系：观察发现工程菌进入稳定期时菌体产量最高， IFN的活性也最高，因此，把握收获时机在干扰素生产中尤为重要。 参见： 1、王树君等，α2a型基因工程干扰素发酵工艺的研究，微生物学免疫学进展，2001年第29卷第2期. 2、王树君等，调解发酵温度提高干扰素的表达，中国生物制品学杂志，1993,6(1):17. 思考题 1、名词解释： 质粒分裂不稳定、质粒结构不稳定。 2、简述影响质粒不稳定的因素及解决方法。 3、简述温度对基因工程菌培养的影响。 4、简述溶解氧对基因工程菌培养的影响。 第八节 基因工程药物的分离纯化 建立分离纯化工艺的依据 分离纯化的基本过程 分离纯化的技术 选择分离纯化方法的依据 1、原料来源较丰富，但有效物质含量极低； 2、设备技术含量低，操作简单，生产周期长； 3、没有使用高分辨率的层析分