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实验一 二硝基水杨酸比色法测定总糖含量 （4学时） 一、实验目的 （1）掌握二硝基水杨酸比色法测定总糖的原理。 （2）学习分光光度计的使用方法。 （3）掌握比色定糖法操作技术。 二、实验原理 在碱性条件下，还原糖与3，5-二硝基水杨酸共热，3，5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其他产物，在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度成一定比例关系，在540nm波长下测定棕红色物质的吸光度，查对标准曲线并计算，便可分别求出样品中还原糖的含量。总糖可在强酸条件下水解，得到还原糖，从而间接求出样品中总糖的含量。 三、实验仪器 （1）刻度试管：25 mL； （2）烧杯：100 mL； （3）三角瓶：100 mL； （4）容量瓶：100 mL； （5）刻度吸管：1 mL，2 mL，10mL； （6）恒温水浴； （7）沸水浴； （8）离心机（过滤法不用此设备），离心管或玻璃漏斗，电子天平，分光光度计。 四、实验试剂 （1）1 mg/mL葡萄糖标准液：准确称取0.250 g分析纯葡萄糖（预先80℃烘至恒重），置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到250 mL容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。 （2）3，5-二硝基水杨酸试剂：将6.3 g 3，5-二硝基水杨酸和262 mL 2mol/L的NaOH溶液，加到500 mL含有185 g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5 g结晶酚和5 g亚硫酸钠，搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定容至1000 mL，贮于棕色瓶中备用。 （3）碘-碘化钾溶液：称取5.0 g碘、10 .0g碘化钾，用蒸馏水溶解至100mL。 （4）酚酞指示剂：称取0.1 g酚酞溶于70%乙醇至250 mL。 （5）6 mol/L HCl，6 mol/L NaOH。 （6）小麦淀粉，食用面粉。 五、实验操作 1．制作葡萄糖标准曲线 取7支刻度试管，按下表操作。 管号 0 1 2 3 4 5 6 葡萄糖标准液/mL 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 蒸馏水/mL 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 3，5-二硝基水杨酸/mL 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 将各管内液体混匀，在100 ℃水浴中加热5 min，取出冷却至27~30 ℃后以蒸馏水定容至25 mL，将各管摇匀，将分光光度计调至540 nm 波长，用零号管调零，再读取1~6号管的吸光度，然后将读取的吸光度为纵坐标，葡萄糖 mg数为横坐标，绘制出标准曲线。 2．还原糖及总糖的待测液的制备 （1）还原糖待测液的制备：取3.0 g小麦淀粉，置于100 mL三角瓶内，缓缓加入50 mL蒸馏水，边注水边搅拌，直至均匀溶解，将溶液置于于50 ℃恒温水浴加热20 min，离心机过滤5 min，用20 mL蒸馏水清洗残液，再用离心机过滤，然后将2次上清液集中于100 mL容量瓶中，蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。 （2）样品中总糖的水解和提取：准确称取1.0 g食用面粉，放在100 mL的三角瓶中，加入10 mL 6 mol/L HCl及15 mL蒸馏水，置于沸水浴中加热水解30 min，取1~2滴水解液于白瓷板上，加1 滴碘-碘化钾溶液，检查水解是否完全，如已经水解完全，则不显蓝色。待三角瓶中的水解液冷却后，加入1滴酚酞指示剂，以6 mol/L NaOH中和至微红色，过滤，再用少量蒸馏水冲洗三角瓶及滤纸，将滤液全部收集在100 mL的容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，混匀。精确取10mL定容过的水解液，移入另一个100mL的容量瓶，以水稀释定容，作为总糖待测液。 （3）显色和比色，取4支25 mL 刻度试管，编号，按下表所示的量操作。 管号 还原糖测定管号 总糖测定管号 ① ② Ⅰ Ⅱ 还原糖待测液/mL 2 2 0 0 总糖待测液/mL 0 0 1 1 蒸馏水/mL 0 0 1 1 3,5-二硝基水杨酸/mL 1.5 1.5 1.5 1.5 将各管内液体混匀，在沸水浴中加热5 min，取出冷却至36 ℃，蒸馏水定容至25 mL。将分光光度计调至540 nm波长，以葡萄糖零号管调零，在分虽读取①、②、Ⅰ、Ⅱ4个管的吸光度。 3．还原糖及总糖的测定 以管①、②的吸光度平均值和管Ⅰ、Ⅱ的吸光度平均值，分别是在标准曲线上查出相应的还原糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖和总糖的含量。 六、结果处理 （1）标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色。 （2）用其他含糖材料，以试验材料比较其含糖量的差异。 （3）小麦淀粉中含有何种糖？在提取总糖时，其他杂质是否会影响到测定？ 实验一 二硝基水杨酸比色法测定总糖含量 实验操作第一步省