生化分離讲义.docVIP

一、绪论 1、生化分离技术：生物技术下游加工过程（Downstream Processing）生化物质的提取分离精制，是生物化学工程的一个重要组成部分。 2、分离对象特点：多数是生物活性分子，如激素、蛋白质、酶、核酸、多糖等。 3、分离对象结构：单体 大分子 复合分子 超分子复合物 细胞器。 4、生化分离技术包括：层析分离，沉淀分离，电泳分离，超离心分离，膜分离技术。 5、生化分离的特点：（具经验性，均一性的相对性） （1）组分复杂：细胞细胞碎片、蛋白质、核酸、脂类、糖类、无机盐等； （2）浓度低：青霉素：3.6%，庆大霉素：0.2%，胰岛素：0.001%； （3）分离过程中容易失活：pH、离子强度、温度等变化； （4）性质不稳定：空气氧化、微生物污染、蛋白质水解等。 6、生化分离技术的分类： （1）制备技术：获得生物体内某一单纯组分。 （2）分析技术：各组分分离后定性、定量、鉴定。 7、分离效率的评价 评价一个分离过程的效率主要有三个标准：目标产物的浓缩程度，分离纯化程度，回收率。 8、下游加工过程遵循的原则 （1）时间短；（2）温度低；（3）pH适中；（4）勤清洗、消毒 二、发酵液预处理 1、发酵液的过滤 （1）助滤剂：悬浮液中的颗粒很细时，过滤时很容易堵死过滤介质的孔，或所形成的滤饼在过滤的压力差作用下，孔隙很小，阻力很大，使过滤困难。 （2）常用助滤剂： a、硅藻土 ：由硅藻土经干燥或煅烧，粉碎、筛分而得到粒度均匀的颗粒，其中主要成分为含80～95％SiO2的硅酸 b、珍珠岩：珍珠岩粉末在1000℃下迅速加热膨胀后，经粉碎、筛分得到粒度均匀的颗粒，其主要成分为含70％SiO2的硅酸铝 c、石棉：石棉粉与少量硅藻土混合而成 d、炭粉、纸浆粉等 （3）助滤剂的要求 a、能形成多孔饼层的刚性颗粒； b、具化学稳定性； c、具不可压缩性：在过滤操作压强差范围； d、助滤剂的添加量，一般在固体颗粒重量的0.5%以下。 2、离心 （1）离心：分离细胞，除去或回收菌体或细胞、血球细胞、细胞器、病毒、蛋白质的分离。 （2）离心分级方法 a、差速离心法：采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒在不同的分离速度及不同的离心时间下分批分离的方法，称为差速离心法。 b、区带离心：差速区带离心， 特点：ρmax σmin (ρ为介质密度、σ为粒子密度) 等密度梯度离心，特点：ρmax σmin (ρ为介质密度、σ为粒子密度) 3、细胞破碎 （1）破碎方式（记几种方法，弄透） a、机械：固体剪切（高速珠磨、压榨） 液体剪切（高压匀浆、超声破碎、撞击破碎） b、非机械：干燥处理（空气干燥、真空干燥、冷冻干燥、溶剂干燥） 溶胞作用（化学法——酸碱、化学试剂：表面活性剂、有机溶剂、变性剂；酶法；物理方法——微波罚、物理渗透法、冻融、压力释放） （2）不同破碎方法的比较 a、机械方法：细胞完全破碎，碎片小,全部释放，粘度高，时间短效率高，需专用设备，通用性强，成本低，实验室工业范围。 b、非机械方法：局部溶解壁膜，碎片大，部分释放，粘度低(核酸少)，时间长、效率低，不需专用设备，通用性差，成本高，实验室范围。 三、双水相萃取 1、双水相系统：将两种不同的水溶性聚合物的水溶液混合时 ,当聚合物浓度达到一定值 ,体系会自然地分成互不相溶的两相。 2、聚合物的不相溶性：当明胶与琼脂（或可溶性淀粉）溶液相混时 ,得到一个混浊不透明的溶液 ,随之分为两相 ,上相含有大部分水 ,下相含有大部分琼脂 (或淀粉 ),两相的主要成分都是水。 3、双水相萃取的原理 双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似 ,都是依据物质在两相间的选择性分配 ,但萃取体系的性质不同。 当物质进入双水相体系后 ,由于表面性质、电荷作用和各种力 (如憎水键、氢键和离子键等 )的存在和环境因素的影响 ,使其在上、下相中的浓度不同。（主要:静电作用和疏水作用） 4、双水相萃取的优点 （1）条件温和。与传统的萃取方法相比，由于双水相萃取体系中的两相大部分 (质量分数 0.7)是水，所形成的两相不涉及有机溶剂，对被分离的物质不会起破坏作用，所使用的聚合物有时还对被分离物质起保护作用，无三废处理之需，所以特别适合生物活性物质的分离提纯； （2）操作方便。所使用的设备简单，操作方便，即使在常温下操作亦不易导致失活；由于是双水相，两相间的张力小，有利于萃取，且可直接与后续提纯工序相连接，无需进行特殊的处理；分相时间短，一般为 5～15min （3）回收率高。提纯的倍数可达2-20倍，如体系选择适当，回收率可达80%-90%以上，且分离速度快 （4）易于大规模生产: 10mL离心管实验结果可以准确放大到处