生化實验报告4.docxVIP

生物化学实验报告纤维素酶活力的测定还原糖的测定--3,5-二硝基水杨酸法刘欣怡 201100140057 2011级生物基地班 周一下午 同组者：刘艺2013年4月8号 周一下午一、实验目的1、学会并掌握用3、5—二硝基水杨酸法测定酶活力方法。2、巩固使用分光光度计。3、掌握还原糖和总糖测定的基本原理。4、学习比色法测定还原糖的操作方法。二、实验器材1、试剂：（1）3、5—二销基水杨酸显色液：称取10克3、5-二销基水杨酸，溶入蒸馏水中，加入20克分析纯氢氧化钠，200克酒石酸钾钠，加水500毫升，升温溶解后，加入重蒸酚2克，无水亚硫酸钠0.5克。加热搅拌，待全溶后冷却，定容至1000毫升。存于棕色瓶中，放置一周后使用。（2）纤维素酶：0.05g酶溶解定容至50ml，取1ml再定容至100ml待测（用PH4.5乙酸-乙酸钠缓冲液配制）。即20μg/ml。（3）0．5%羧甲基纤维素钠水溶液（CMC）：用0.1mol/LPH4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液配置，溶解后成胶状液，静置过夜。使用前摇匀。（4）标准葡萄糖溶液：称取干燥至恒重的葡萄糖100毫克，溶解后定容至100毫升，此溶液含葡萄糖1.00毫克/毫升。（5）西瓜汁：使用新鲜的西瓜现场榨得西瓜汁，并且过滤以备用。（6）蒸馏水2、器材：722型分光光度计、水浴锅、电炉、多个比色管、移液枪、烧杯、不同型号的移液管、多个试管、枪头、试管架、多个胶头滴管、洗耳球、温度计、试管夹、量筒等。三、实验原理1、纤维素酶：纤维素酶是一种多组分酶，包括C1酶、CX酶和β-葡萄糖苷酶三种主要组分。其中C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，CX酶的作用是将无定形纤维素继续水解成纤维寡糖，β-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在550nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。产生纤维素酶的菌种容易退化，导致产酶能力降低。纤维素酶在食品行业和环境行业均有广泛应用。在进行酒精发酵时，纤维素酶的添加可以增加原料的利用率，并对酒质有所提升。由于纤维素酶难以提纯，实际应用时一般还含有半纤维素酶和其他相关的酶，如淀粉酶（amylase）、蛋白酶（Protease）等纤维素酶种类繁多，来源很广。不同来源的纤维素酶其结构和功能相差很大。由于真菌纤维素酶产量高、活性大，故在畜牧业和饲料工业中应用的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。常见的畜禽饲料如谷物、豆类、麦类及加工副产品等都含有大量的纤维素。除了反刍动物借助瘤胃微生物可以利用一部分外，其它动物如猪、鸡等单胃动物则不能利用纤维素。近年来，国内外利用真菌纤维素酶成为提高畜禽生产性能和饲料利用率的重要措施之一。2、酶活力：酶活力（enzyme activity）也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适。3、本实验中酶活力定义：1g酶每分钟水解生成1微克葡萄糖的量定义为一个活力单位。由此定义我们可以计算本实验中的纤维素酶活力。4、还原糖：能够还原斐林(H.von Fehling)试剂或托伦斯(B.Tollens)试剂的糖称为还原糖，所有的单糖（除二羟丙酮），不论醛糖、酮糖都是还原糖。大部分双糖也是还原糖，蔗糖例外。斐林试剂是含Cu2 络合物的溶液，被还原后得到砖红色Cu2O的沉淀。托伦斯试剂被还原后能生成单质银，在试管壁上可看到“银镜”。?分子结构中含有还原性基团（如游离醛基或游离羰基）的糖，叫还原糖。如葡萄糖。果糖含有游离的醛基，所以果糖也属于还原糖。一般情况下，单糖的还原能力主要来自它的醛基，如葡萄糖，而多糖则大多因为半缩醛羟基的存在。还原后，自己会变成糖酸。如葡萄糖就会变成葡萄糖酸。?如该糖是一酮糖，酮基就会断裂，分解成两个较小的分子，如果糖。除蔗糖外，所有单糖及双糖在本尼迪克特试验中呈阳性反应，所以所有单糖及双糖都具有还原性。但有时果糖可能会算作非还原糖处理。还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-