生化實验报告2.docVIP

实验实验目的 二、实验设备及材料 1. 所需试剂 （1）硫酸铜 （2）硫酸钾 （3）浓硫酸 （3）氢氧化钠 （4）硼酸 （5）盐酸 （6）溴甲酚绿 （7）95%乙醇 （8）甲基红 （9）无水碳酸钠 （10）蒸馏水 仪器 1 BUCHI定氮仪（型号）、消化炉（型号）及消化管、消化管架、消化管夹 2 超声波清洗机 3 塑料桶 4 电子天平（0.1mg） 5称样勺 6 烧杯 7 玻璃棒 8 1000ml或2000ml定容瓶 9 电炉 10 酸式滴定管 11 马弗炉 12. 250ml锥形瓶 13. 胶头吸管 14. 棕色小瓶三、实验原理天然有机物(如蛋白质、核酸及氨基酸等)的含氮常用微量凯氏定氮法来测定。 当被测的天然含氮有机物与浓硫酸共热时，分解出氮、二氧化碳及水。氮转变出的氨与硫酸化合生成硫酸铵。分解反应进行得很慢，可加入硫酸铜及硫酸钾或硫酸钠促进之，其中硫酸铜为催化，硫酸钾或硫酸钠可提高消化液的沸点。氧化剂过氧化氢也能加速反应。 消化完了后，在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解，放出氨。用水蒸汽蒸馏法，将氮蒸入过量标准无机酸溶液中，然后用标准碱溶液进行滴定，确测定氨量，从而折算出含氮量。 以甘苷酸为例，该过程的化学反应如下: CH2-COON │ ＋3H2S04→2C02＋3S02＋4H20+NH3 NH2 2NH3十H2S04→(NH4)2SO4 (NH4)2S04+2NaOH→2H2O+Na2SO4＋2NH3↑ 测定时常用硼酸溶液收集氨，氨与溶液中的氢离子结合，生成铵离子，使溶液中氢离子浓度降低。然后再用强酸滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度为止。所用的强酸的当量数即相当于被测样品中氨的当量数。 本法适用的范围为0.2-1.0毫克氮。相对误差应小于±2％。2. 基本试剂配制 （1）催化剂：硫酸铜 0.5g＋硫酸钾3.0g/支管； （2）0.2％溴甲酚绿溶液：95%乙醇溶液作溶剂0.2克溴甲酚绿100ml 95%乙醇（?0.1克50ml） （3）0.2％甲基红溶液：95%乙醇溶液作溶剂；0.2克甲基红100ml 95%乙醇（?0.1克50ml） （4）40％氢氧化钠溶液补充给机器自带的桶，不要让管子里有气泡； （5）0.01mol/l 盐酸滴定液量取9ml盐酸，加适量水并稀释至1000ml。混匀，待标定。3. 实验试剂配制 （1）催化剂：硫酸铜 0.5g＋硫酸钾3.0g/支管； （2）1％硼酸溶液：要盖住，最好2周用完或用桶装； （3）指示剂：5份0.2％溴甲酚绿-乙醇溶液与1份0.2％甲基红-乙醇溶液混合；酸性显红色，中性显葡萄紫色，碱性显绿色。实验步骤 1. 称样： 称取0.5克干样品于消化管中，每管加入催化剂硫酸铜0.5克和硫酸钾3.0克，再加入10毫升浓硫酸。 2. 消化 机器设定： 3. 蒸馏 机器设定： 锥形瓶中加1％硼酸溶液3滴指示剂，变蓝色4. 滴定盐酸滴定蛋白质测定表格： 时间： 测定人： 编号 样品类型 样品重g HCl用量（ml） HCl浓度（mol/l） 1 空白 2 空白 3 4 . 计算 样品的总氮含量克氮/%=[（A-B）×N×14/m×1000]×100 注：“空白”滴定值包括水及氢氧化钠溶液中含有的微量的氮。因此，水质对“空白”滴定值的影响甚大。“消化样品”最后用“消化空白”进行校正计算，“不消化的样品”最后用“不消化的空白”进行校正计算。而且，在实脸中，稀释样品的水与“空白”的应取自于同一瓶中。 样品中的蛋白质含量克/%=（A-B）×N×14×6.2500×100/m×1000 式中:A：为滴定样品用去的盐酸平均毫升数;B：为滴定空白用去的盐酸平均毫升数;m：为称量样品的克数;实验中使用盐酸的实际浓度;14：为氮的原子量;6.25：为系数1毫升0.1N盐酸相当于0.14毫克氮。 盐酸标准滴定溶液0.1mol/L）的标定(GB/T5009.1-2003) 1）标定：精密称取约0.15g在270～300干燥至恒量的基准无水碳酸钠，加50ml水使之溶解，加10滴溴甲酚绿-甲基红混合指示液，用本溶液滴定至溶液由绿色转变为紫红色，煮沸2min，冷却至室温，继续滴定至溶液由绿色变为暗紫色。 注：用本指示剂，0.01mol/l 盐酸滴定，终点为很淡的粉红色 （）计算公式：（HCl）（mol/L）=m/[V1－V20.0530] 注： m：为称量Na2CO3样品的克数;V1：样品的滴定体积V2：空白管的滴定体积0.0530：是与1.00ml盐酸标准滴定溶液[HCl）＝1mol/L]相当的基准无水碳酸钠的质量，g 实验测定 实验目的 . 学习使用比色法测定生物样品中