生物技術综合实验自编教材1.docVIP

生物技术综合实验指导 生物技术综合实验 化学与生命科学学院 刘杰凤 王 颖 马 超 董宏坡 尹爱国合编 2 0 10年 8月 引 言 随着生物技术的发展，生物工程的专业技术人员的需求更为迫切，特别是生物技术已经渗透到各个行业，并已蓬勃发展。生物技术的发展不但要有深厚的理论基础，而且要求专业技术人员具有较强的动手能力，因为该学科是一门实践性较强的科学。在培养生物技术专业学生时要特别注意学生实验能力的培养，尤其是专业基本操作。 本专业学生的实验课程已经包括生物化学实验、微生物实验、基因工程实验、细胞工程实验和发酵工程实验等课程实验。这些实验为培养学生的基础操作能力、提高学生的实际动手能力等奠定了良好的基础，但是这些实验都是单个的小实验，各个实验各自为一体，没有系统地相互关联，学生完成实验后没有一个完整的概念。 本实验以基因工程、细胞工程和发酵工程实验为基础，组成了生物工程中上游、中游和下游技术。其中每一个部分放弃了原来单独小实验的结构，而改为一个独立的大实验，增加了学生的设计性和主动性。这些实验既注重和加强了原来各自的实验内容，又注意到相互联系。 本讲义分为三个部分，第一部分“DNA重组技术与基因检测芯片技术”；第二部分“动物细胞培养及细胞活性检测技术”；第三部分“发酵工程及分离提取技术”。这些实验采取大实验方法，使学生有一个完整的操作过程，对理解生物工程的上游、中游和下游技术有了感性认识。 目 录 第一部分 分子生物学与基因工程实验 1 实验一 质粒的制备 1 实验二 DNA的琼脂糖凝胶电泳 2 实验三 外源DNA片段在质粒载体中的克隆 3 实验四 感受态细胞的制备 5 实验五 质粒的转化及转化子的鉴定 7 （一）、热激法转化 7 （二）、电转化法 7 实验六 植物总DNA的快速少量抽提 9 （一）、SDS提取法 9 （二）、CTAB提取法 10 实验七 总DNA质量检测及酶切 10 实验八 PCR技术 11 第二部分 蛋白质的分离、纯化 13 动物肝脏过氧化氢酶的提取分离纯化 13 动物血中超氧化物歧化酶的提取与纯化 15 实验一 紫外分光光度法测定蛋白质含量 20 实验二 考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量 22 实验三 过氧化氢酶活力的测定 24 实验四 离子交换柱层析法分离纯化蛋白质 26 实验五 SDS电泳测定蛋白质分子量 29 附录 33 附录一 试剂配方 33 附录二 硫酸铵饱和度常用表 36 附录三 常用缓冲溶液的配制 38 参考文献 39 第一部分 分子生物学与基因工程实验 实验一 质粒的制备 质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。 质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。 一、 实验目的 掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。 二、实验材料 含有质粒pUC18载体的大肠杆菌菌液，克隆有水稻外源片段的BAC的大肠杆菌菌液。 三、实验原理 在pH 12.0 ~ 12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。 四、实验步骤 1. 取含有pUC18质粒的大肠杆菌菌液于LA培养基上37℃过夜培养； 2. 用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有Amp抗生素的LB培养基中，37℃摇床~250 r/min过夜培养； 3. 吸取1.5 ml菌液，12000 g离心2min，收集菌体，倒掉菌液；吸取1.5ml菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净； 4. 加入300μl溶液 I振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）； 5. 加入300μl溶液II，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过5min； 6. 加入300μl溶液III颠倒混匀，放置于冰上10min，使杂质充分沉淀； 7. 12000 g离心10分钟； 8. 吸取800 μl上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂质）至另一Eppendorf管中，加入2/3体积的异丙醇，室温下放置5min； 9. 12000 g 常温离心15min； 10. 倒尽上清，加75％乙醇浸洗除盐（放置片刻或离心3min后倒去上清）； 11. 室温放置或超净台上风干DNA； 12. 加