生理學实验--斑马鱼视动反应讲义.docVIP

斑马鱼视动眼动反应 实验目的： 观察视觉行为学的表现 掌握评判视觉功能的行为学手段 实验原理： 行为学虽是一门古老的学科，但至今仍是神经生理研究中不可或缺(indispensable)的一个活跃领域。经典行为学实验一般不依赖或很少需要精密的测量仪器，而是靠我们去观察和思考。眼动(optokinetic response, OKR)和视动(optomotor response, OMR)反应均是视觉刺激诱发的运动行为。脊椎动物从低等的鱼、蛙到高等的灵长类和人都有此行为反应。此现象无需学习训练就易诱导、较稳定、易观察，所以作为一种客观指标广泛运用于视觉功能的检测和评价。 脊椎动物为了获得对运动图像刺激在视网膜上稳定清晰的成像，通过视觉通路和相应的运动神经参与做出生理性行为的适应调整从而能够对视觉刺激做出良好反应，这些表现涉及视动、眼动或视动性头震颤(Optokinetic head nystagmus, OKHN)。如果行为学的表现不正常，可以推测它们的固有神经连接出现异常。斑马鱼具有脊椎动物类似的视觉通路，经典的视觉行为学有眼动反应和视动反应。 眼动(光动)反应：(图1)，斑马鱼的眼睛就会一直追随光栅直到其眼睛不能再转动，然后有一个急速的眼颤动(ocular nystagmus)以回复到最初水平。之后又进行下一个追随反应，如此循环。周围视觉环境周期性运动时引起的有规律的眼或头追踪运动(慢相运动)即为眼动反应或视动性头震颤。五天龄(5dpf) 的幼鱼视觉系统就已非常成熟(viewed in Bilotta, 2001)。(图2)。 图1 眼动反应装置 图2 成鱼视动反应装置 实验设备： 试剂： 30 mm Petri dish，6% methylcellulose（Sigma），Embryo media，Rearing water (见附表)，海绵，橡皮泥，动脉夹，大头针，7-9dpf幼鱼，成鱼，计时器，烧杯 仪器： OKR apparatus (图3), 体式镜，视频摄录设备，微波炉，搅拌加热台 实验步骤 Part 1: 成鱼OKR 1. 自制海绵块（如图4）; 2. 将海棉块放在玻璃杯的底部，倒入少部分的水，挤出海绵中的气泡; 3. 插入第一根针，位置大概在海绵的中间; 4. 麻醉成鱼，用动脉夹夹住尾巴; 5. 将鱼背部朝上放在海绵上，一侧的胸鳍放在大头针的前面; 6. 插入第二根针，位置在对侧胸鳍的后面，类似于第一根针; 7. 在鱼缸的壁上靠近鱼尾的位置蘸上一块橡皮泥，将动脉夹按在橡皮泥 上; 8. 在生殖孔的两侧分别插入第3、4根大头针; 9. 在第1、2与第3、4之间分别插入第5、6根大头针; 10. 腮部两侧分别插上第7、8根大头针; 11. 为了防止鱼体上浮，第9、10根针在背鳍前部附近斜插跨过鱼的身体; 12. 倒入养鱼水，水深6cm左右; 13. 让斑马鱼苏醒10min; 14. 打开光源，光强度适应1min; 15. 打开电动机，光栅刺激适应1min; 16. 记录眼动反应。 注意事项: a. 大头针的目的只是为了固定住斑马鱼，因此只要能达到这个目的，大头针没有必要太紧以影响到鱼的正常呼吸和生理功能; b. 用以小片纱布裹住鱼的尾巴，然后再用动脉夹夹住可以减少尾巴断裂的可能性; c. 腮部旁边的两个大头针不能阻挡它对光栅的视野。 Part 2: 幼鱼OKR A. 甲基纤维素 幼鱼的固定是用甲基纤维素来进行的，一般常用的是6%的，配制如下： 1. 将140ml ddH2O放进微波炉中高档加热3min; 2. 在玻璃烧杯中加入60ml的ddH2O，并放入冰箱中冰冻; 3. 将沸腾的热水转移到热台上并搅拌; 4. 称取12g methylcellulose，缓慢的倒进沸水当中，当甲基纤维素在表面逐渐成块的时候可以用玻璃棒在水面轻微搅动以促进其溶解; 5. 继续搅拌3 min直到methylcellulose充分分散开来, 加入3~5滴 NaOH (1mol/L)并继续搅拌3~5min; 6. 将上述容易转移进一个塑料的烧杯中，然后加入60 ml 的冰块迅速冷却; 7. 当溶液因快速冷却而变得透明的时候将其放进冰箱，静置2h后可用。 注意: a. 为了防止剧烈的冷却对玻璃烧杯的损伤，可以将热的溶液转移进塑料烧杯中进行; b. 当冰块加入之后溶液变得透明，还应继续在冰箱中保持2h以上，否则不会形成粘稠样液体。 B. 幼鱼准备 1. 前一天下午五点将一雌二雄配对在繁殖缸中，第二天早上抽板并在1h后收集鱼卵; 2. 鱼卵用embryo medium在 28.5 ℃ 孵育，光照/黑暗周期为14:10h; 3.