人血浆非对称性二甲基精氨酸浓度的rphplc测定法.docVIP

人血浆非对称性二甲基精氨酸浓度的RPHPLC测定法 【摘要】nbsp; 目的:建立一种测定人血浆中非对称性二甲基精氨酸（Asymmetric Dimethylarginine，ADMA）浓度的反相高效液相色谱法（RP-HPLC）。方法:采用 Waters symmetry C18柱（5μm，3.90 mm×150 mm），以0.05 mmol/L乙酸钠（pH6.8）为流动相A，甲醇为流动相B，线性梯度洗脱：14% 15 min，31% 25 min，45% 5 min（V/V/V），流速1.0 ml/min，荧光检测，激发波长330 nm，发射波长450 nm，邻苯二甲醛（OPA）进行柱前衍生，室温下检测。结果:ADMA在0.05～5μg/ml范围内有良好线性关系，最小检出量为0.05μg/ml，平均相对回收率为（93.76±2.57）%，日内、日间平均变异系数分别为(3.25±1.59)%、(4.60±1.37)%。结论:本方法准确、简便、快速，适用于科学研究和临床检测。 【关键词】nbsp; 非对称性二甲基精氨酸 色谱法 反相高效液相 nbsp;nbsp;nbsp; 血浆中非对称性二甲基精氨酸(Asymmetrical dimethylarginine，ADMA)浓度变化与心血管疾病发生发展密切相关，近年来研究显示ADMA升高是一种新的心血管病危险因素[1]。关于血浆中ADMA浓度的检测方法，国外虽已有报道[2，3]，但操作繁琐，干扰因素多。国内曾有采用正相色谱法的报道[4]。本研究在国内外同类研究的基础上适当改进，采用反相色谱法，用一元线性梯度洗脱，建立一套准确、简便、快速的高效液相色谱法检测人血浆中ADMA浓度的方法，报告如下。 nbsp;nbsp;nbsp; 1nbsp; 材料 nbsp;nbsp;nbsp; 1.1nbsp; 试剂nbsp; AMDA标准品、衍生剂OPA、3-巯基丙酸均购自Sigma公司，HPLC分析纯度gt;99.99%；甲醇为一级色谱纯，购自天津市四友生物医药科技有限公司；硼酸为一级色谱纯，购自上海试剂总厂；乙酸钠、冰乙酸、氢氧化钾、5-磺基水杨酸为分析纯，购自上海试剂总厂。 超纯水（18.25 MΩ·cm）。 nbsp;nbsp;nbsp; 1.2nbsp; 仪器与设备nbsp; 高效液相色谱仪为Agilent1100系列，包括G1322在线脱气机、G1311A四元泵、G1316A柱温箱、G1321A FLD荧光检测器；自动进样器；Agilent化学工作站（RevA.08.03.[847]）。 高速离心机（TGL-16G，上海安亭科学仪器厂出品）；漩涡混合器（XW-80A,上海医科大学仪器厂生产）；电子分析天平（AB204-A，上海梅特勒-托利多仪器公司灵敏度0.1 mg）；超纯水制备机（杭州永洁达净化科技有限公司生产）。 nbsp;nbsp;nbsp; 1.3nbsp; AMDA工作液配制nbsp; 准确称取ADMA标准品10 mg于100 ml容量瓶中，用超纯水溶解并定容，得浓度为100μg/ml ADMA储备液。再用超纯水依次稀释为1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml的ADMA工作液，贮存于4 ℃备用。 nbsp;nbsp;nbsp; 1.4nbsp; 流动相A配制nbsp; 精密称取乙酸钠4.1 g，用重蒸水溶解后，在1000 ml容量瓶中定容，用2 mol/L冰乙酸调节pH值到6.8，即得浓度为0.05μmol/L，pH6.8的乙酸钠溶液，然后用0.45μm 滤膜过滤，超声脱气。 nbsp;nbsp;nbsp; 1.5nbsp; OPA衍生剂配制nbsp; 精确称取OPA 20 mg，加400μl的甲醇，0.2 mol/L硼酸3.6 ml（pH=9.5），3-巯基丙酸20μl，混匀避光（现配，现用）。 nbsp;nbsp;nbsp; 2nbsp; 方法和结果 nbsp;nbsp;nbsp; 2.1nbsp; 色谱条件nbsp; 色谱柱：Waters Symmetry C18柱（5μm，3.9 mm×150 mm），保护柱：Waters Symmetry C18 保护柱（5μm，3.9 mm×20 mm）；流动相：A为0.05μmmol/L乙酸钠（pH6.8），B为甲醇，按B 14% 15 min，31% 25 min，45% 5 min（V/V/V）梯度洗脱；进样量20μl；流速1.0 ml/min；柱温40 ℃；荧光检测波长：激发波长330 nm，发射波长450 nm。 nbsp;nbsp;nbsp; 2.2n