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凝血酶诱导非小细胞肺癌血管内皮生长因子分泌的实验
凝血酶诱导非小细胞肺癌血管内皮生长因子分泌的实验
nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp; 作者:王盛兰 王熙才 伍治平 金从国 陈晓群 蒋永新 谷玉兰 陈艳 周永春 腾毅山
【摘要】nbsp; 目的探讨凝血酶对非小细胞肺癌细胞株A549分泌血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)的促进作用及其机制。方法采用ELISA法检测凝血酶对A549细胞分泌VEGF的浓度以及水蛭素对其阻断作用。采用RTPCR法检测凝血酶受体PAR1在A549细胞中的表达。结果凝血酶在0.5~3U/ml的浓度范围内可以明显地增加VEGF的分泌,而<0.5U/ml时这种促进作用则不明显,水蛭素能够完全阻断凝血酶的这种促进作用。PAR1在A549细胞中表达,而在正常的胎肺细胞(KMB17)中并不表达。结论在一定浓度范围内,凝血酶能有效地促进A549细胞VEGF的分泌,而这种促进作用可能与PAR1受体的表达有关。
【关键词】nbsp; 凝血酶; 水蛭素; 非小细胞肺癌; 血管内皮生长因子
nbsp;nbsp;nbsp; 1材料与方法
nbsp;nbsp;nbsp; 1.1主要材料Trizol试剂,购自天为时代生物有限公司;RTPCR试剂盒、PCR试剂盒,由MBI公司生产;凝血酶冻干粉、重组水蛭素冻干粉,由SIGMA公司生产;人VEGF ELISA试剂盒,购自深圳晶美生物有限公司;RPMI1640培养基,购自GIBCO公司;新生小牛血清,购自中国医学科学生物工程研究所。nbsp;
nbsp;nbsp;nbsp; 1.2方法
nbsp;nbsp;nbsp; 1.2.1细胞培养nbsp;nbsp; A549细胞于RPMI1640培养基+10%小牛血清,对数生长期收集细胞,调整细胞浓度为2×105/ml, KMB17细胞于DMEM培养基+10%小牛血清培养。
nbsp;nbsp;nbsp; 1.2.2ELISA方法检测VEGF的分泌(1) 标本收集肺非小细胞肺癌患者血清138份(包括腺癌57例、鳞癌68例、大细胞癌13例),保存于-20℃冰箱。(2) 细胞培养上清液的收集① 将A549细胞稀释到上述浓度,接种于24孔板,培养6h后细胞贴壁生长,更换细胞培养液同步24h。实验分组(每组8孔):凝血酶0.5U/ml组、凝血酶1.0U/ml组、凝血酶3.0U/ml组、以1640培养液为空白对照,收集细胞培养上清液保存于-20℃。② 将A549细胞稀释到上述浓度,接种于24孔板,培养6h后细胞贴壁生长,更换培养液。实验分组(每组8孔):凝血酶3.0U/ml细胞、凝血酶3.0U/ml细胞+3.0U/ml水蛭素、以1640培养液为空白对照,分别在6、16、24h收集细胞培养上清液保存于-20℃。(3) VEGF的测定按照人VEGF ELISA试剂盒说明进行测定,在实验中标准品和样本均双复孔检测。
nbsp;nbsp;nbsp; 1.3逆转录聚合酶链式反应
nbsp;nbsp;nbsp; 1.3.1细胞A549、KMB17总mRNA的提取(1) 直接在贴壁生长细胞的培养瓶中加入Trizol(1ml/10cm2),用尖吸管反复吹打几次后,将裂解液移入EP管中,加入1/5nbsp; Trizol体积的氯仿,充分震荡,4℃ 12000g×5min;(2) 吸上层水相移入新管,加1/2体积的异丙醇,4℃ 12000g×10min去上清,沉淀用75%乙醇洗涤,-20℃放置20min, 4℃ 12000g×15min;(3) 去上清,室温干燥,4℃ 12000g×5min,沉淀溶于20μlnbsp; DEPCddnbsp; H2O中;(4)紫外分光光度仪测量OD值,分析浓度和纯度。
nbsp;nbsp;nbsp; 1.3.2RTPCR按检验试剂盒说明书分RT及PCR两步进行:① 分别加入5μg总RNA、cDNA合成引物酶抑制剂、dNTP、MMLV逆转录酶、DEPCdd H2O,至终体积20μl,42℃×60min, 70℃×10min。② 加入PCR反应体系、上下游引物、超净水进行反应。循环条件:热启动94℃、30s;57℃、30s;72℃、1min,31个循环;延伸72℃、7min。扩增PAR1 cDNA。PAR1引物:上游引物5’CCACAAACGTCCTCCTGATT3’和下游引物5’TGGGATCGGAACTTTCTTTG3’,扩增片段大小为200bp。同时扩增βaction作为内参照物。引物序列为:5’ACACTGTGCCCATC3’和5’AGGGGCC
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