細菌的革兰氏染色及染色液的配制.docVIP

革兰氏染色一般步骤革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram创立。未经染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。革兰氏染色属复染法，即将标本固定后，先用结晶紫染色1分钟后水洗，然后加革兰碘液媒染一分钟后用酒精脱色，再用稀释石炭酸红复染。染色后除可以看到细菌形态外，还可将细菌分为两大类，即不被酒精脱色而保留紫色者为革兰氏阳性菌（G＋）。被酒精脱色复染成红色者为革兰氏阴性菌（Gˉ）。革兰氏染色原理尚不肯定，可能与细菌所带核糖核酸、细菌壁结构通透性、等电点等因素有关。致病菌如金黄色葡萄球菌、绿色溶血性链球菌、肺炎球菌、白喉杆菌、炭疽杆菌等属革兰氏染色阳性菌。百日咳杆菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌、流行性脑膜炎双球菌、淋病双球菌等均属革兰氏阴性。所以根据细菌的革兰氏染色性质，可以缩小鉴定范围，有利于进一步分离鉴定，以对疾病做出诊断。又由于各种抗生素的抗菌谱不同，革兰氏染色尚可做为选用抗生素的参考。 革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是： 1）涂片固定。 2）草酸铵结晶紫染1分钟。 3）水冲洗。 4）加碘液覆盖涂面染1分钟。 5）水洗，用吸水纸吸去水分。 6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30秒后水洗，吸去水分。 7）红色液（稀）染10秒钟后，水冲洗。干燥，镜检。 染色的结果，革兰氏正反应菌体都呈紫色，负反应菌体都呈红色。 二、齐氏(Ziehl)石炭酸复红染色液 　　 A液：碱性复红(basic fuchsin) 0．3g 　　 95%酒精 10ml 　　 B液：石炭酸 5．0g 　　 蒸馏水 95ml 　　 将碱性复红在研钵中研磨后，逐渐加入95%酒精，继续研磨使其溶解，配成A液。 　　 将石炭酸溶解于水中，配成B液。 　　 混合A液及B液即成。通常可将此混合液稀释5—10倍使用，稀释液易变质失效，一次不宜多配。 三、革兰氏(Gram)染色液 　　 1．草酸铵结晶紫染液 　　 A液：结晶紫(crystal violet) 2g 　　 95%酒精 20ml 　　 B液：草酸铵(ammonium oxalate) 0．8g 　　 蒸馏水 80ml 　　 混合A、B二液，静置48小时后使用。 　　 2．卢戈氏(Lugol)碘液 　　 碘片 1．0g 　　 碘化钾 2．0g 　　 蒸馏水 300ml 　　 先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶后，加足水分即成。 　　 3．95%的酒精溶液(脱色用)。 　　 4．番红复染液 　　 番红(safranine O) 2．5g 　　 95%酒精 100ml 　　 取上述配好的番红酒精溶液10ml与80ml蒸馏水混匀即成。 四、芽孢染色液 　　 1．孔雀绿染液 　　 孔雀绿(malachite green) 5g 　　 蒸馏水 100ml 　　 2．番红水溶液 　　 番红 0．5g 　　 蒸馏水 100ml 　　 3．苯酚品红溶液 　　 碱性品红 11g 　　 无水酒精 100ml 　　 制法取上述溶液10ml与100ml5%的苯酚溶液混合，过滤备用。 　　 4．黑色素(nigrosin)溶液 　　 水溶性黑色素 10g 　　 蒸馏水 100ml 　　 称取10g黑色素溶于100ml蒸馏水中，置沸水浴中30分钟后，滤纸过滤二次，补加水到100ml，加0．5ml甲醛，备用。 五、荚膜染色液 　　 1．黑色素水溶液 　　 黑色素 5g 　　 蒸馏水 100ml 　　 福尔马林(40%甲醛) 0．5ml 　　 将黑色素在蒸馏水中煮沸5分钟，然后加入福尔马林作防腐剂。 　　 2．番红染液 　　 与革兰氏染液中番红复染液相同。 六、鞭毛染色液 　　 A液：单宁酸 5g 　　 FeCl3 1．5g 　　 蒸馏水 100ml 　　 福尔马林(15%) 2．0ml 　　 NaOH(1%) 1．0ml 　　 配好后，当日使用，次日效果差，第三日则不宜使用。 　　 B液：AgNO3 2g 　　 蒸馏水 100ml 　　 待AgNO3溶解后，取出10ml备用，向其余的90mlAgNO3中滴入浓NH4ON，使之成为很浓厚的悬浮液，再继续滴加NH4OH，直到新形成的沉淀又重新刚刚溶解为止。再将备用的10mlAgNO3慢慢滴入，则出现薄雾，但轻轻摇动后，薄雾状沉淀又消失，再滴入AgNO3，直到摇动后仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止。如所呈雾不重，此染剂可使用一周，如雾重，则银盐沉淀出，不宜使用。 七、富尔根氏核染色液 　　 1．