第八章 外源基因的表达课件.pptVIP

包涵体的形成 ①折叠状态的蛋白聚集作用 高表达导致水难溶的折叠态蛋白分子间相互作 用而聚在一起 ②非折叠态的蛋白聚集作用 在较高培养温度的细菌中，热稳定性差的蛋白 处于非折叠态，以二硫键等结合在一起 ③蛋白折叠中间体的聚集作用 由于折叠中间体的难溶而聚在一起 包涵体表达的优缺点 包涵体表达的优点： 简化外源表达蛋白的分离 保持表达产物结构稳定 包涵体表达的缺点： 表达的外源蛋白丧失了原有生物活性，必须经过有效的变性、复性操作，才能得到具有正确空间构想的活性蛋白体 融合蛋白 外源蛋白基因与受体菌蛋白基因重组，不改变两个基因的阅读框，表达的蛋白为融合蛋白 Gene Protein A B A B N C 融合蛋白的优点： 在自身蛋白引导下，形成良好的杂合构象，可很大程度封闭蛋白水解酶切割位点 某些情况下，具有水溶性和一定生物活性 易于分离纯化 寡聚型外源蛋白 低拷贝质粒，多基因串联排列。目的蛋白高表达，非目的蛋白低表达。 多个转录元排列 大分子量蛋白 同于转录元，多编码框排列 中等分子量蛋白 同一编码框，多肽段排列 小分子量蛋白 整合型外源蛋白 分泌型外源蛋白 在信号肽引导下分泌到胞外或周质中 5.高效表达外源基因的策略 优化载体设计 密码子偏爱性 mRNA稳定性 表达蛋白稳定性 优化发酵过程 二.酵母表达系统 酵母(yeast)是一类芽殖或裂殖进行无性生殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲、担子菌纲和半知菌纲，是外源基因最理想的真核生物基因表达系统。 ①基因表达调控机制比较清楚，遗传操作简单 1996年完成了酿酒酵母全基因组测序 ②具备蛋白翻译后的加工和修饰系统 ③可将外源基因表达产物分泌到培养基中 ④安全性好，对人与环境无害 ⑤可进行大规模发酵，工艺较简单 酵母表达外源基因的优势 载体一般包含的元件 ①DNA复制起始区 酵母自主复制序列 来源于天然2μ质粒 YEp 来源于酵母自主复制序列(ARS) YRp ②选择标记 营养缺陷型选择标记 显性选择标记 ③有丝分裂稳定区(CEN) YCp 酵母表达载体 ④表达盒(expression cassette) 启动子、分泌信号序列、终止子 启动子上游含有各种调控元件 如: 上游激活序列(UAS) 上游阻遏序列(URS) 组成型启动子序列 酵母表达宿主菌 ①酿酒酵母 应用与研究最早 乙醇积累影响酵母生长与基因表达 蛋白过度糖基化 分泌能力不强 ②巴斯德毕赤酵母 甲醇营养菌 甲醇可诱导与甲醇代谢相关酶高效表达 利用甲醇诱导的乙醇氧化酶基因AOX1启动子 高效表达外源基因 三.哺乳动物细胞基因表达系统 哺乳动物细胞基因表达系统的优势 更好的蛋白辅助折叠系统 蛋白糖基化、磷酸化、寡聚体、二硫键形成等蛋白加工系统 可直接表达具有完全生物功能的活性蛋白 哺乳动物表达载体 载体一般包含的元件 ①哺乳动物细胞中进行基因转录的元件 启动子、增强子、终止子、poly(A)信号、内含子剪切信号 ②基因表达调控元件 ③细菌中进行复制和筛选的元件 ④筛选转化子的选择标记 常用筛选转化子的选择标记 哺乳动物常用表达载体 哺乳动物常用受体细胞 三.植物基因表达系统 一个转基因细胞就可发育成一株转基因个体 可得到一个转基因的完整生命系统 培养条件简单、生产成本低 * * 外源基因的表达 第一节 基因表达的机制 1.外源基因的转录 2.mRNA的延伸与稳定性 3.外源基因mRNA的有效翻译 4.表达蛋白在细胞中的稳定性 5.目的基因的沉默 1.外源基因的转录 启动子类型： 组成型启动子 原核生物T7启动子 诱导型启动子 原核生物lac、trp等 组织特异性表达启动子 2.mRNA的延伸与稳定性 原核生物避免序列存在衰减子(attenuator) 带有正常转录终止序列 受体细胞情况 A B trp衰减子 带有正常转录终止