【2017年整理】BIAcore技术及其应用.doc

BIAcore技术及其应用　　BIA(biomolecular interaction analysis)技术是基于一种称为表面等离子共振(surface plasmon resonance， SPR)的物理光学现象发展起来的新型生物传感分析技术，自1990年正式出现后，有关该技术利用的研究便迅猛发展起来了。由于该技术的实时监测性、样品无需标记及快速自动化等突出优点，到目前为止全世界已有几百个实验室的工作涉及到它，应用领域也已从最初的单纯研究免疫中抗原抗体相互作用的动力学机制扩展到了细胞粘附、蛋白伴侣等许多新型领域。　　1.BIA技术的基本原理　　BIA技术的关键是利用了基于SPR现象发展的生物传感器作为检测系统。一般情况下，当入射光以临界角入射到两种不同透明介质的界面时将产生全反射，且反射光强度在各个角度上都应相同。但若在介质表面镀上一层金属薄膜后，由于入射光可引起金属中自由电子的共振，从而导致反射光在一定角度内大大减弱，其中使反射光完全消失的角度称作共振角(SPR Angle)。共振角会随金属薄膜表面通过的液相的折射率的改变而改变，且折射率的变化又与结合在金属表面的生物大分子质量成正比。因此，BIA技术可以通过对反应全过程中各种分子反射光的吸收获得初始数据，并经相关处理获得各动力学参数从而完成对分子间相互作用的研究。利用SPR进行检测分析的具体情形如图1所示。图1　SPR检测分析原理　　2.BIA技术分析装置——BIAcore系统 　　现在利用BIA技术进行检测的主要装置是Pharmacia公司的产品——BIAcore系统。该系统的基本组成部分及工作原理如图2、3所示。图2　BIA装置图3　传感图　　(1) 传感片(Sensor chip)　　该部分是BIA系统的关键组成。它是实时BIA信号传导的载体。通常情况下，传感片为一片表面镀有金属薄膜的玻璃载片。而在金膜表面布满共价固定的亲水性集团以提供一个可与生物分子发生偶联的专一性结合表面。现在最常用的传感片为CM5(表面吸附有羧甲基葡聚糖)［1］。　　(2) 微射流卡盘(Microfluidics)　　BIA系统利用其作为液体传送系统，将极少量的样品及试剂输入流通池。由于系统有计算机自动控制，它可以保证实验的精确性及重复性。　　(3) BIA操作的辅助软件　　通常有用于分析传感图数据，计算反应动力学参数的BIA评鉴软件(BIA Evulation)及利用已知动力学参数模拟真实实验的BIA模拟软件(BIA Simulation)两种。 　　3　BIA技术的应用　　BIA技术尽管被广泛应用于生物学与医学的许多领域，但就其应用原理不外乎以下三种：动力学研究、生物分子结合位点研究、生物分子浓度测定。　　3.1　动力学研究　　BIA技术最早的应用即是对免疫中单克隆抗原抗体相互作用的动力学研究［2］。Magulies等［3］利用BIA技术研究MHC、TCR与多肽抗原三者的相互作用。他们在测定了三者相互作用的亲和常数及动力学参数后提出一个相当有说服力的生物学模型：即T细胞的激活依赖于抗原递呈细胞表面大量的抗原多肽-MHC复合物对单个T细胞表面大量TCR的刺激。除用于免疫学的基础研究外，BIA技术由于能提供抗原-抗体间的反应动力学参数以大大提高筛选质量而被用于加快、优化免疫测定的开发。这也是目前BIA技术在免疫学方面的最大应用。　　3.2　生物分子结合位点的研究　　利用BIA技术进行结合位点的分析为生物大分子相互作用关系的研究提供了一个强有力的工具。由于它可获取靶分子的拓扑结构信息及结构变换与功能的关系，从而被广泛用于蛋白质之间、DNA之间及蛋白质-DNA间的结合分析。(尤其是蛋白质-DNA间作用的研究已成为研究基因表达调控的关键所在)。　　在研究蛋白质间的相互作用中，对蛋白伴侣(Chaperones)的研究一直是热点之一。在几乎同一时期，Plunkhum［4］领导的研究小组与以Hartl［5］为首的实验组分别利用BIA技术开展对细菌中两种已知蛋白伴侣GroEL和GroES的研究。前者主要研究内酰胺酶的各种构型与GroEL结合的作用；后者则利用BIA技术验证了其先前提出的蛋白伴侣工作机理模型。他们的做法都是将GrolEL偶联于BIA装置的传感片上，不同的是在传感片表面流过的样品不一样。Hartl等是使GroES与ATP一起流过传感片表面，从传感图上可以观测到GroES与GroEL的结合过程及ATP的存在促使GroES从GroEL上解离，且可算出ATP存在下的解离常数，从而显示该Kd值(动态常数)与ATP被GroEL水解时的Kd值完全一致。该结论的正确性已得到其它相关实验结果进一步证明。　　在分子生物学领域，BIA技术在DNA-蛋白质相互作用研