E.coli轉化子的筛选与验证.docVIP

E.coli转化子的筛选与验证 实验目的 掌握使用红白菌落法筛选获得重组子的方法，了解红白筛选的原理。学习用用试剂盒法对重组子进行重组质粒的抽提，并对其进行酶切鉴定，以确定重组质粒中含有外源DNA片段。 实验原理 因pUC19质粒（pBS）带有氨苄青霉素抗性基因（Ampr），而外源片段上不带该基因，故转化受体菌后只有带有pBS DNA的转化子才能在含有氨苄青霉素（Amp）的LB平板上存活下来；而只带有自身环化的外源片段转化子则不能存活。此为初步的抗性筛选。 pBS上带有b-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和b-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点，但并没有破坏lacZ的阅读框架，不影响其正常功能，E.coli DH 5a菌株带有b-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下，pBS和DH5a融为一体的b-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在pBS和DH5a融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的b-半乳糖苷酶阴性突变体之间可以实现互补的现象叫a-互补。 在麦康凯培养基上，a-互补产生的Lac+细菌由于含b-半乳糖苷酶，能分解麦康凯培养基中的乳糖，产生乳酸，使pH下降，因而产生红色菌落，而当外源片段插入后，失去a-互补能力，因而不产生b-半乳糖苷酶，无法分解培养基中的乳糖，菌落呈白色。因此可将重组质粒与自身环化的载体DNA分开。此为a-互补现象筛选。 在含氨苄青霉素的培养基上生长的白色菌落可能存在假阳性情况，即白色菌落可能是目的菌落，也有可能是载体自连后发生突变的菌落，因此还需要琼脂糖凝胶电泳来检测是否含目的基因以及重组质粒DNA分子的大小。 实验仪器及试剂 1.仪器 恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅， 琼脂糖凝胶电泳装置， 电热恒温培养箱，电泳仪，， 微量移液枪，eppendorf管，牙签，试剂盒，离心柱。 2.试剂 1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl (pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。 任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液。50 mM葡萄糖最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质 粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配 在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达 10 mM 的EDTA，目的是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。NaOH也使DNA变性，但只是个副产物，在溶液3加入后其中的醋酸和NaOH中和，质粒DNA恢复活性 2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置?。 这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，目的是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱 性。NaOH是最佳 的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，遇到碱性物质都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向 micelle（微囊）结构的相变化所导致。有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，加SDS，那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。 3. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存备用。 溶液III加入后就会有大量的沉淀，这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度 的盐，使得沉淀更完全。SDS能与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质 沉淀了，同时将基因组DNA沉淀。加入2 M的醋酸是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断