紫外可见分光光度技术详解.ppt

紫外-可见分光光度技术 设备 可移动机械狭缝型分光光度计 二级管阵列型分光光度计 可移动机械狭缝型分光光度计 光源 单色器 检测器 光源 紫外光区（180-400nm）用氘灯 400nm以上的可见光区用钨灯 市场上也有采用卤素灯的产品 单色器 从混合光获得单色光的光学元件 通常用棱镜或衍射光栅作为光的色散元件 然后通过狭缝结构获得波长范围尽可能狭窄（如约1nm）的单色光束 通过狭缝结构的移动可以选择不同波长的单色光 检测器 接受单色透射光的元件 由光电倍增管构成 它可以接受光信号，并将透射光的强度转换成电信号。 模拟信号（Analog signal） 数字信号（Digital signal） 以透射光强度的变化作为波长的函数得到的平面图既吸收光谱，或称扫描图。 双光束型分光光度计 其光源产生的两束光同时通过样品池与参比池 这两个透射光束之间强度的差别则反映了样品吸收光的强度。 单光束分光光度计 单一光束通过样品池。 如果用这种仪器进行定量分析，在将样品池放入光束中读出其吸收值之前，必须将只含溶剂的参比池放入光束中，通过调整使其光吸收值为零来进行校准。 结构 光源 狭缝 棱镜 狭缝 样品池 入射光 透射光 光电倍增管 信号记录 二级管阵列型分光光度计 一种依靠光电二级管阵列（Photodiode Array，PDA）采集光信号的分光光度计。 工作原理 光源整个光谱范围的光全部穿过样品 然后将透射光色散 经过色散的全波长的光同时落在光电二级管阵列上 任何非常狭窄的波带被置于适当位置上的各个二级管接受，并转换成电信号。 同时收集所有光电二极管输出的信号 可在非常短的时间（微秒）内记录样品的全波程吸收光谱。 意义 PDA的出现是对紫外—可见吸收光谱技术来说，是一个革命性的突破。 它最突出的优点是可以迅速提供被检测组分在一定波长范围内的扫描图。 结构 光源 狭缝 棱镜 样品池 入射光 透射光 光电二极管阵列 仪器参数 波长范围 带宽 量程 基线漂移 …… 仪器的校正 光源 波长 吸光度 比色杯 光源校正 发射能量的降低 狭缝的调节—单色性 波长的校正 紫外光区—无水乙醇： 229.2nm 233.9nm 238.9nm 243.3nm 248.5nm 260.6nm 268.4nm 吸光度的校正 确定化合物 确定浓度 不同波长 不同吸光度 比色杯的校正 不同杯的比较 测量条件的选择 波长 狭缝 量程 定性分析 光谱特征 最大吸收峰 峰形 细微结构 …… 定性结论 归纳推理 化合物纯度的鉴定 类胡萝卜素顺式异构体 …… 结构推断 原子吸收光谱 E原子=E电子 电子跃迁=能量吸收 原子吸收光谱 分子吸收光谱 E分子=E电子+ E震动+E转动 分子能及跃迁=能量吸收 分子吸收光谱 分子吸收光谱 电子吸收光谱—紫外—可见 震动吸收光谱—红外 转动吸收光谱—远红外 电子吸收光谱（UV-VIS） 分子的外层电子跃迁造成的吸收光谱 成键电子 非键电子 反键电子（能级最高） 分子的外层电子跃迁 s（sigma）-s* n-s* n-p* p-p* s-s*跃迁 s*反键轨道 ?200nm 真空紫外区 饱和烷烃 甲烷：125nm 乙烷：135nm …… n-s*跃迁 n-电子：非键轨道电子=孤对电子 跃迁能 s-s*跃迁能 150-250nm 摩尔吸光系数：100-300 饱和烃类 n-p*和p-p*跃迁 n电子和 p电子比较容易激发 ?200nm 不饱和官能团—含有p键-生色团 n-p*跃迁：摩尔吸光系数=10-100 p-p*跃迁：摩尔吸光系数=1000-10000 单个不饱和官能团：摩尔吸光系数=104 n-p*和p-p*跃迁 溶剂极性增加： n-p*跃迁：紫移 p-p*跃迁：红移 定量分析 根据Beer-Lambert定律，样品液(y毫升)中样品的量x 毫克能由下列公式计算： x=(A×y×1000)/(A1%1cm×100) A1%cm的定义为在1厘米光程长的比色杯中1%（W/V）浓度溶质的理论吸收值。 定量分析 比色 内标 外标—标准曲线 外界条件对光谱的影响 溶剂环境的影响 温度的影响 存在状态的影响 游离态 复合态 溶剂环境 分子能级跃迁的能量与溶剂的折射率有关 当溶剂的折射率增加时，光谱会发生红移。 当溶剂的折射率降低时，光谱会发生紫移。 类胡萝卜素在不同溶剂中的λmax值 水的影响 当含水量达到30－50%时，类胡萝卜素的光谱会出现一个新的强吸收峰，而通常的主吸收带的强度会减弱。 新峰的位置通常在紫外区 番茄红素：354nm 叶黄素：370nm 玉米黄素：380nm 这个峰通常相当窄，并且无精细结构。 温度的影响 在低温下，分子的紫外－可见光谱形状可能会发生根本性变化。 10-40nm的红移 光谱精细结