【2017年整理】实验九、十、十一.docVIP

PAGE PAGE 9 实验九 人类染色体标本制备及核型分析 目的 了解人类外周血淋巴细胞染色体玻片标本制备方法。 观察正常人体细胞染色体的形态、数目，掌握核型分析方法。 试剂与器材 1． RPMI-1640培养基、小牛血清、PHA（5mg/ml）、秋水仙素（10μg/ml）、肝素（600 IU/ml）、固定液（甲醇：冰醋酸＝3：1）、低渗液（0.075mol/L氯化钾）、5%NaHCO3溶液、三蒸水、双抗(青、链霉素)、Giemsa染液（1%）、PH6.8磷酸缓冲液。 2． 超净工作台、恒温培养箱、恒温水浴箱、鼓风干燥机、离心机、冰箱、高压消毒锅、分析天平、注射器、培养瓶、离心管、滴管、滤器、滤膜、酒精灯、载玻片。 3． 显微镜、人类染色体玻片标本、拭镜纸、二甲苯、香柏油、人类染色体放大照片、核型纸、剪刀。 内容 1． 观看电教：人体外周血培养及染色体标本的制备。 2． 人体外周血淋巴细胞的培养及染色体玻片标本制作。 3． 正常人体细胞染色体核型分析。 人类染色标本的制作 (一) 实验原理 人体外周血淋巴细胞是保持了增殖潜能的暂不增殖细胞（G0细胞），一般可在血液中循环几年都不分裂。但在人工离体培养条件下，若在培养基中加入PHA（phytohemagglutinin，植物血细胞凝集素），PHA可刺激G0细胞转化为淋巴母细胞，重新获得增殖能力，并进行有丝分裂。然后在培养基中加入适量秋水仙素（colchicne），使分裂细胞停滞于中期。用低渗溶液处理，使分裂细胞膨胀。细胞悬液滴片后，通过加热使已膨胀的细胞爆裂，将染色体分散开来。最后用Giemsa染色，即可获得中期染色体标本。 (二) 操作步骤 1． 培养液配制 RPMI-1640粉剂10.4g，碳酸氢钠2.0g，溶于1000ml三蒸水中，过滤除菌。 2． 在无菌条件下，用量筒取 RPMI-1640 80ml 灭活胎牛血清 20ml 青霉素 100U/ml 链霉素 100U/ml 将上述溶液混匀，用5%灭菌碳酸氢钠或1mol/L HCl，调整培养液PH至7.2-7.4，分装培养瓶，每瓶5ml，使用前，每瓶临时加1%PHA0.5-2ml，用注射器5号针头滴入500μg/ml肝素，摇匀。 3. 培养 (1) 采血和培养 用灭菌注射器抽取600μg/ml的肝素0.2ml，润湿针筒，然后将多余的肝素弃去。常规消毒被检者的肘部皮肤，从肘部静脉采血1ml，分装于培养液的培养瓶中，每瓶装入全血10滴(7号针头)，摇匀，静置于37℃恒温培养箱中，培养68 -72小时。 (2) 秋水仙素处理 终止培养前4小时-6小时，加入10μg/ml秋水仙素0.2ml，使最终浓度为0.4μg/ml。轻轻摇匀，放回培养箱中，继续培养4 -6小时。 4． 低渗处理 (1) 收集细胞：用吸管将培养物混匀，并移至10ml刻度离心管内，以1000r/min离心8分钟。 (2) 低渗处理：吸去上清液，加入预热至37℃的0.075mol/LKCL,用吸管混匀，放回37℃水浴箱中，静置15分钟。 5. 固定 (1) 预固定：低渗15分钟后，加入新配制的固定液(甲醇：冰醋酸=3：1)1ml，混匀。静置15分钟后，以1000r/min离心8分钟。 (2) 固定：除去上清液，加入固定液8ml，混匀，静置30分钟，以1000r/min离心8分钟。(3) 再固定：除去上清液，加入固定液8ml，混匀，静置30分钟，以1000r/min离心8分钟，除去上清液。视细胞数量的多少，加入少许固定液，制成细胞悬液。 6. 制片 (1) 滴片：用吸管吸取上述细胞悬液3-4滴，滴于在冰水中浸泡后的清洁载片上，随即呼气吹片，使细胞散开，自然干燥。 (2) 染色：用1∶10的Giemsa染色20-30分钟，自来水冲洗，干后镜检，封片。 (三) 注意事项 1． 凡是细胞培养过程中所涉及的一切溶液试剂和玻璃器材必须保证严格无菌。 2． 用于制备培养基的水达不到质量要求是细胞培养失败的主要原因之一，因而要使用三蒸水。 3． PHA效价不好是细胞分裂相少的原因之一，因此，培养基中PHA的使用量要在试用后确定。 4． 在细胞培养过程中，每天至少要摇瓶一次，以利于细胞良好生长。 5． 如果染色体分散不好，可先将载玻片用45%的冰醋酸液浸湿，然后立即将细胞悬液滴在载玻片上，并立即在酒精灯火焰上来回通过3～5次，这可在很大程度上改善染色体的分散状况。 正常人体细胞的核型分析 (一) 正常人体细胞染色体标本的观察 取上述制好