【2017年整理】组织培养基本技术与基本知识.docVIP

PAGE PAGE 72 组 织 培 养 基本技术与基本知识 2005.10.15 目 录 前言5 基本技术6 第一节 原代细胞单层静止培养的设备与器材准备6 一、 设备与器材 二 、 器材的清洗 第二节 原代细胞单层旋转瓶培养的设备与器材准备11 一 、 设备与器材 二 、 器材的清洗 第三节 组织培养用水的制备和各种溶液的配制12 水（双蒸水、三蒸水或去离子水） 汉克氏（Hanks）原液和汉克氏液 0.5%水解乳蛋白汉克氏液（简称乳汉液）的配制 7.5%的碳酸氢钠（NaHCO3）配制 胰蛋白酶的配制 犊牛血清的制备 每毫升含1万单位双抗（青霉素与链霉素）的配制 每毫升5万单位制霉菌素的配制 营养液与维液的配制 第四节 器物与溶液的包装、灭菌和无菌操作16 包装与灭菌 无菌操作 第五节 无菌检验23 第六节 原代单层细胞的制备24 第七节 细胞计数和染色26 细胞计数 细胞染色 第八节 培养细胞的观察27 培养细胞的生长和繁殖 在单层细胞培养中细胞的形态观察 第九节 原代单层细胞培养中应注意的问题29 应注意的问题 可能会出现的问题 在组织培养的细胞中病毒的接种与毒价的滴定（测定）31 第一节 在组织培养的细胞上病毒的接种方法32 一、用敏感细胞分离病毒 二、病毒在敏感细胞中的传代 接种后细胞病变（CPE）的观察与判定标准 第二节 在组织培养细胞中病毒毒价的测定34 病毒毒价测定操作方法 半数细胞病变终点（TCID50）计算 基本知识41 第一节 影响离体细胞生长繁殖的一些因素41 一、温度 二、氢离子浓度 水 渗透压与无机盐类 A、细胞所需无机盐离子的作用 B、无机盐类对平衡渗透压和维持pH的作用 气体 细胞接种浓度 容器转动速度 第二节 细胞的营养物质49 碳水化合物 氨基酸和水解乳白蛋白 血清 （一）、血清的作用 （二）、与血清有关的几个问题 维生素 第三节 消化液的应用56 胰蛋白酶 乙烯二胺四乙酸（Versene，EDTA） 胶原酶 Pronase 第四节 抗菌素的应用61 青霉素 链霉素 第五节 传代细胞与细胞悬浮培养62 传代细胞 细胞悬浮培养 附录65 附录Ⅰ 猪瘟兔化弱毒细胞冻干疫苗（旋转瓶培养）制造及检验办法65 附录Ⅱ 禽苗的鸡胚细胞苗试制67 附录Ⅲ 应用驴胎肺等二倍体细胞生产马传染性贫血病琼脂扩散反应抗原操作方法—68 前言 为了适应我国畜牧业的发展，防止各种畜、禽流行病的爆发和流行，需要生产大量的家畜家禽的各种疫苗，而目前不少疫苗的生产尚未探取组织培养的方法，存在着成本高，费人力，劳动强度大，有些疫苗的原料比较难于得到或需要耗费较多的家畜或家禽，例如狂犬疫苗的生产，目前还是采用绵羊的脑子来制造，一只羊只有脑子能利用。因此，国内有不少兽医生物制品厂和研究单位已探取组织培养的方法生产各种疫苗。例如：猪瘟疫苗的生产，原采用乳兔和黄牛进行生产，而现在已推广仔猪肾细胞组织培养方法生产，一对仔猪肾所生产的苗就相当于以前500—1000只乳兔或30—40头黄牛所生产的量，这不仅使成本成倍的下降，原料易得，节省了人力，而且使劳动强度大大减轻。除此之外，口蹄疫甲型和乙型的组培灭能苗和甲型组培弱毒苗已进行试生产，猪水泡病的组培弱毒苗与组培反映苗也正在进行试制。鸡马力克氏病和新城疫Ⅰ系和Ⅱ系组培苗许多单位在进行试验，并已取得可喜成果。另外如鸭瘟、羊痘等组培苗的生产也在进行试验，并已看到初步苗头。 以上的简略介绍仅涉及到组织培养技术在动物疫苗生产方面的应用，而这一技术在免疫学和病毒学中还有着许多方面的应用，如病毒性疾病的诊断；马传染性贫血病的诊断抗原—补体结合反应抗原和琼脂扩散反应抗原，在国内乃是行之有效而广泛采用的方法。利用组织培养：细胞作中和试验以诊断一些病毒性也是经常采用的。另外组织培养技术在病毒的分离、监定和繁殖规律：研究以及病毒毒价的测定等方面都是不可缺少的手段。尤其当用于医学时，组织培养方法能够克服在人医中不能用人进行实验的困难。 组织培养技术除了在病毒学和免疫学和医学中有多方面应用外，其应用范围还极其广泛。如细胞学、肿瘤学、药理学等方面以成为不可缺少的工具，而且在遗传学、发生学、生物化学、生理学、放射生物学等方面也有广泛的应用价值。 然而，事物总是一分为二的。组织培养使组织或细胞在体外生长繁殖以便于进行多方面研究和应用。但是，机体内外环境却是极为不同的。在体外，则使组织或细胞处于不正常的条件下，必然会