生物制药学第三章 基因工程制药（参考）.pptVIP

基因工程表达一药物蛋白研究阶段和生产阶段分离纯化策略 重组类人胶原蛋白 胶原是结缔组织的结构蛋白 胶原蛋白是在提取胶原时，结构没有改变的一类蛋白 羟脯氨酸 重组类人胶原蛋白是通过逆转录在人体中钓取基因后，进行了某些位点的突变，并在大肠杆菌中表达的重组蛋白 分子量70，000 方法：亲和层析纯化  发酵后的工程菌，5000r/min离心30分钟 质液比1：6将菌体悬浮于细胞破碎缓冲液中（1mmol/LEDTA,5mmol/LTris） 冰水浴中超声波破碎仪间断超声十次，每次90秒 破碎液于4℃，5000r/min离心1小时，收集上清液 上清液用硫酸铵分级沉淀 收集15%~65%饱和度的蛋白质沉淀 沉淀溶解在缓冲溶液中（20 mmol/ LTris-HCl，pH8.0） 截流分子量30，000的超滤膜脱盐浓缩 脱盐的样品和平衡缓冲液（1mmol/LNaCl）1：1混合 层析柱用锌离子充分螯合，并用10倍体积的平衡缓冲液平衡 上样后，平衡液冲洗，挂柱 100 mmol/ L的NH4Cl洗脱 * 包含体产物分离工艺（牛生长激素分离提取） 第十节 基因工程药物介绍 一、重组胰岛素 胰岛素的作用是降低血糖浓度，达到治疗糖尿病的目的 猪胰岛素,不良反应 1982年开始，美国等批准用DNA重组技术生产的人源化胰岛素 三种生物合成胰岛素的方法 (a) AB链分别表达法 体外折叠成功率低，通常只有10～20％ (b) 人胰岛素原表达法 由于C肽的存在，胰岛素原在复性条件下能形成天然的空间构象，为三对二硫键的正确配对提供了良好的条件，使得体外折叠率高达80％以上 目前Ely Lily用这种工艺路线年产几十吨的重组人胰岛素，其经济效益相当可观。 (c) AB链同时表达法 1957年Isaccs等发现病毒干扰现象，即病毒感染的细胞能产生一种因子，作用于其他细胞干扰病毒复制，因而命名为干扰素。 根据产生干扰素细胞的来源、理化性质和生物活性等差异，可分为α、β、γ等3种，其中IFN-α为多基因产物，有23种以上的亚型。 二、重组干扰素α 上个世纪50年代末期临床应用，从血液中直接提取 70年代，直接从供血的白细胞中直接提取 目前一般采用大肠杆菌表达系统生产 干扰素α可以明显地抑制胸腺癌、某些淋巴肿瘤和多发性骨髓瘤，还能抑制骨髓型肉瘤手术后肿瘤的复发 三、重组水蛭素 1884年，John Haycraft发现了医用水蛭的提取物中含有抗凝血的物质 1957年，德国的Fritz Markwardt 从医用水蛭的唾液腺中分离纯化出这种抗凝血的物质，并命名为水蛭素 水蛭素现在已经能用大肠杆菌和酵母进行生产 实例二 引物，PCR扩增 PCR产物连接到T载体上 转化大肠杆菌 T载体双酶切 表达载体双酶切 体外连接 转化大肠杆菌 提取质粒 转化到酵母中 活性检测 实例三 鲨鱼肝总RNA OligodT 逆转录第一链 鲨肝活性肽N端序列，OligodT cDNA双链 连接到T载体上 双酶切 T载体和表达载体 体外连接两个片段 转化到大肠杆菌中 测序，与多肽序列对照 诱导表达 电泳检测分子量，活性试验 第五节 基因工程菌的稳定性 工程菌的不稳定性大多数是由于质粒不稳定造成的 一、工程菌的稳定性 质粒分裂的不稳定 :工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象 质粒结构的不稳定 : 指外源基因从质粒上丢失或者碱基重排、缺失而导致的工程菌性能的改变 1. 质粒不稳定产生的原因 含质粒菌产生不含质粒菌的比率 两种菌的比生长速度差异的大小 插入的外源基因影响了质粒稳定区的结构 2. 提高质粒稳定性的方法 两阶段培养法 发酵工艺条件的优化 选择合适的宿主菌或质粒 增大选择压力 固定化技术 两阶段培养法 菌体生长的一定阶段的时候，进行诱导表达 大肠杆菌的pET系统 毕赤酵母 发酵工艺条件的优化 通过适当发酵工艺，可以提高质粒的稳定性，可以间隙改变发酵的环境参数，如温度、溶氧量、酸碱度等 选择合适的宿主菌或质粒 根据表达蛋白的性质，选择合适的宿主菌和质粒搭配 pET系统中的宿主菌有BL21、DE3、DH10B等，质粒有pET－3、5、12、14、、17、21、22、25、28、32、34、40等 相对而言，Kan抗性的质粒一般比Amp抗性稳定 增大选择压力 Amp的工作浓度一般在50μg/ml，发酵培养是可以加大到200μg/ml 固定化技术 将细胞固定在载体上进行培养 第六节 重组蛋白高表达策略 一、大肠杆菌表达系统 1. 外源基因的拷贝数 2. 外源基因的表达效率 3. 表达产物的稳定性 4. 细胞的代谢负荷 5. 发酵条件的优化 外源基因