第七章 受工体细胞.pptVIP

与Southern印迹杂交不同之处： RNA电泳 避免单链RNA自身形成高级结构和自身降解 变性凝胶电泳(甲醛、尿素、甲酰胺等) RNase抑制环境 3. 菌落(或噬菌体)原位杂交 1975年，M.Grunstein和D.Hosness提出菌落原位杂交 1977年，W.D.Benton和R.W.Davis噬菌斑原位杂交 不必分离细菌或噬菌体DNA, 经溶菌和变性处理 后，使DNA暴露出来并于滤膜结合 印迹 碱处理； 烘烤 加入探针 3. 核酸杂交的探针 (1)常用探针类型： ①同源或部分同源 19-24bp ②总cDNA探针 ③特异cDNA探针 ④人工合成寡核苷酸探针 (2)探针标记物 ①放射性标记物 32P 高放射性 半衰期14.3 d 35S 放射性较弱 半衰期87.1 d 3H 放射性弱 半衰期12.35 a ②非放射性标记物 生物素(biotin) 地高辛(digoxigenin) Biotin Avidin BCIP/NBT 紫蓝色沉淀 Dig 抗Dig抗体 碱性磷酸酶 (3)探针标记方法 化学法 酶标记法 ①切口平移法(nick translation labeling) 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ DNA酶I DNA聚合酶I\标记的dNTP 5’ 3’ 变性 探针平均长度600bp (2) cos位点突变型 1985, Rosenberg 三.受体细胞选择 受体细胞 利于外源DNA的转化或转导 具有较好的安全性 如：野生型大肠杆菌作为受体菌的不足之处 自身限制-修饰作用，对外源DNA具一定降解作用 存在潜在治病性 诱变等方法进行遗传性状改良，获得突变型菌株: ①限制-修饰系统 限制系统缺陷型菌株(hsdR -) ②重组系统 重组蛋白缺陷型(recA- recB- recC-) ③易于转化或转导 ④有明显的选择性差异 遗传表型差异大, 易于重组子筛选 ⑤感染寄生缺陷型 四.重组DNA分子转入真核细胞 1.重组DNA分子导入植物细胞 (1)农杆菌介导的Ti质粒载体转化法 农杆菌(Agrobacterium) 土壤习居菌 感染绝大多数双子叶植物与蕨类植物 对绝大多数单子叶植物无侵染能力 外植体 用于植物遗传转化的受体，为植物组织或器官 如：叶片、叶柄、子叶、茎、下胚轴等 外植体接种(农杆菌侵染) 外植体浸泡自农杆菌菌液中 注意: 菌液稀\时间短 共培养 感染后的带菌外植体, 在诱导愈伤组织或不定芽培养基上培养 脱菌培养 转移到含有抗生素的培养基上培养,去除农杆菌 常用抗生素: 羧苄青霉素(Carb)、头孢霉素(Cef)等 筛选培养 外源基因抗生素 分化培养 分化培养基 几种外植体的转化方法: ①叶盘转化法 ②整株植物转化法 ③原生质体转化 ④悬浮细胞培养 水稻等,种胚制作悬浮细胞 (2)DNA的直接转移 ①多聚物介导法 聚乙二醇(PEG)、多聚赖氨酸等 ②电穿孔转化法 ③激光微束穿孔法 ④显微注射 ⑤超生波介导转化法 ⑥基因枪 ⑦脂质体介导法 ⑧花粉管导入法 2.重组DNA分子导入哺乳动物细胞 ①病毒颗粒转导法 ②磷酸钙转染法 ③DEAE-葡萄糖转染法 ④聚阳离子-DMSO转染法 ⑤显微注射技术 ⑥电穿孔法 ⑦脂质体介导法 第3节 重组子的筛选 重组子 导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞为 转化子，含有重组DNA分子的转化子为重组子 筛选(screening) 选择(selection) 一. 遗传表型直接筛选法 1.根据载体选择标记初步筛选转化子 (1)抗药性筛选 氨苄青霉素(Ap 或Amp) 氯霉素(Cm或Cmp) 卡那霉素(K