透射电子显微镜技术详解.ppt

C5 剥离、清洗和捞取复型 从冷冻断裂仪中取出样品杯夹，浸入重蒸水，用细针轻轻将样品拨下来（注：不要碰伤复型膜，只拨组织块。如果样品太小可用放大镜协助。） 用腐蚀剂把生物组织彻底腐蚀掉是比较安全可靠的剥离方法，腐蚀的组织与复型膜脱离，而不怕腐蚀的铂一碳复型膜就保留下来了。70％次氯酸钠（俗名花王腐蚀液）、次亚氯酸钠、硫酸、铬酸、硝酸、氢氧化钠、氯仿、丙酮、甲醇等，都能作腐蚀剂。当复型膜全部剥离时，将漂浮起来，此时再用口径稍粗的吸管把复型膜轻轻吸出，随即注入重蒸水中，如上继续清洗2～3次。最后用400目的空网将复型膜捞起，放在垫有滤纸的培养皿中自然晾干。 A3 应用举例 B1 冷冻断裂（蚀刻）和复型技术的应用范围 C1 细胞之间的连接装置 细胞之间的连接装置属于细胞膜的特化结构，用这种技术可以揭示连接装置的超微结构、分布状况及其随病理和生理条件不同的变化等。因此它是把连接装置的超微结构及其功能，与细胞整体的变化联系起来进行研究的一项很有用的技术。如：研究间隙连结的组装过程；研究疾病和药物对细胞连接装置超微结构的影响等。 C2 细胞质膜和细胞核膜 细胞质膜与细胞核膜的超微结构及其功能是生命科学领域研究的热点之一。用这种技术可以研究质膜中多种蛋白质、特异性酶、特异抗原（抗体）等的形态结构和分布情况；研究核膜中的核膜蛋白质与核膜孔的结构；以及研究细胞整体的生理和病理变化对上述膜结构的影响等，如：断裂面空间构型、颗粒分布和密度、细胞识别功能等方面的变化。 C3 细胞质中的某些细胞器 用这种技术也能研究一些与生物膜结构有密切联系的细胞器，如：线粒体（MIT）、溶酶体（LY）、高尔基体（GO）、内质网（ER）等，除了研究它们本身的超微结构及其功能外，还能与整体细胞的生理和病理状况联系起来进行研究，如：人胃癌细胞中高尔基体数量增加、结构特殊等。 C4 细胞突起 各种细胞突起的形态结构及其功能也有区别，并且还与细胞整体的结构及其功能联系密切。如：胃癌细胞的微绒毛呈分技状。用这种技术可以研究多种细胞突起的超微结构及其病理和生理变化，如：纤毛、鞭毛、微绒毛、伪足、皱褶和神经细胞的未梢等。 C5 其它 冷冻蚀刻技术很适于研究具有板层状结构的生物样品，如：胶原纤维、黄体细胞中的螺旋体结构、髓鞘中雪旺氏细胞、肌细胞（骨骼肌、心肌等），以及肺泡D型细胞等。 C6 与其它样品制备技术联合的前景 冷冻断裂（蚀刻）复型技术对于揭示生物膜的结构有独到之处，但由于每个样品只断裂一次，所以对于同一个样品来说，揭示的膜面还是非常有限的，因此，能观察到的信息量也就受到了限制。另外，虽然这种样品的立体感很强，但不同的蛋白质颗粒可能会显示极相似的结构，因此很难区分大大小小的颗粒状的结构群中都含有哪些化学成分。所以在某些情况下，单独用这种技术就显得单薄。弥补的办法是与其它技术联合，即用同一种材料，除了做冷冻蚀刻的样品之外，根据需要还可选用扫描电镜、负染、超薄切片、放射自显影和免疫标记等技术，以获取更多的信息，互相补充，更全面和更深入地分析实验结果。这种多项技术的联合使用已显示出优越性，并日益得到广泛的应用。 B2 制备脂质体样品 脂质体是由磷脂分子组成的一种球形双分子层的膜结构。构成生物膜的脂类，在一定的温度条件下，可由液晶态到晶态互相转变、这种状态的转变被称为相变。而状态转变时的温度被称为相变温度。不同的脂类，其相变温度亦不同，相变点也就不同。通常，在某一种脂类的相变点温度以上时，该脂类为液晶态，又称流动态；而在其相变点温度以下时，该脂类为晶态，又称凝胶态。我们知道，活细胞的膜结构是由多种磷脂分子组成的，如：卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸等。因为它们的相变点都不同，混杂一起难以分清各自的状态，所以要想研究某种脂类相变的特点，必须将其提纯出来，制备成人工膜（即人工脂质体），再制备电镜样品。 研究脂质体的相变特点是研究生物膜的结构与功能的一个重要方面，它有助于揭示生物膜的分子结构、生化和物理性质，以及生理和病理功能之间的内涵。脂质体相变的特点除了受到温度的制约以外，还与许多因素有关，如：光照（紫外光、激光、白炽光等）、药物、其它脂类成分和pH等。 C1 制备脂质体 可以用机械摇动、超声震荡、微量注射和去污剂处理等方法制备脂质体。下面以纯磷脂DMPC和机械震动法为例，介绍制备的方法。 D1 取2mg纯度98％以上的DMPC（二豆寇酰磷脂酰胆碱，相变温度