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第二章 酶的分离和纯化 Isolation and Purification of enzyme 方法概括 原料处理：包括组织破碎、缓冲液抽 粗分级：一般采用硫铵沉淀、乙醇沉淀或其他方法 细分级：一般采用离子交换层析、凝胶层析、亲和层析和电泳 第一节 原料选择及预处理 动物原料：动物组织或脏器（活体取出） 充分脱血 -10℃ — -50℃保存 植物原料：植物原料 磨碎 加入缓冲液抽提 植物原料特点：1）纤维含量高 2）酚酶活力高 3）缓冲液pH易被细胞内物质改变 微生物原料：菌体培养 做酶活—时间曲线 确定最大酶活时间 细胞破碎 微生物细胞破碎一般采用 1）化学法：碱；去垢剂；有机溶剂；酶解；冰冻复融 2）物理法：热处理；渗透压；减压；声波振荡 3）机械法：加磨料；研磨；挤压 4）缓冲液抽提 抽提缓冲液的加入要少量多次，植物酶抽提时可加5mM的Vc 第二节 酶的粗提 沉淀 核酸沉淀：a）MnCl2、硫酸鱼精蛋白、链霉素可使核酸沉淀，离心除掉 （b）加入核酸酶将其降解 杂蛋白沉淀：根据目的酶的特性方法各异 选择性沉淀（盐析）：最常用的方法 沉淀过程中随时监测蛋白浓度和酶活力 讨论： （a）盐的加入速度合适 （b）蛋白质开始沉淀处的硫铵浓度与蛋白浓度有关 （c）硫铵浓度表示法；饱和度25℃4.1M （d）硫铵饱和溶液pH7，若目的酶易酸变性必须用缓冲液 （e）硫铵溶液密度较高（1.24），故需较大离心力 此步可除去75%以上的杂蛋白，且可使蛋白浓缩 透析与浓缩 1）透析袋处理： 透析袋 0.5M EDTA煮半小时 蒸馏水煮半小时 反复八次 带橡皮手套用镊子拿取 2）透析除盐：200倍于被透析物；4小时换一次透析液；监测电导值 Sephadex G25 除盐：柱长50cm；上样小于床体积的20% 3）浓缩：a）火棉胶 b）聚乙二醇（PEG） c）超滤（3-5kg/cm2） d）冻干 透析技术原理图 超滤技术原理图 第三节 酶的精制 一、层析技术（chromatography） 1）分配层析：物质在两相中的分配系数不同 a）纸层 b）薄层(比纸层灵敏100倍但剥板困难) c）柱层 2）吸附层析（absorption chromatography）：吸附剂对通过它的物质吸附力不同，吸附力包括离子引力、疏水作用、范德华力和氢键 a）薄层 b）柱层 填料一般为硅胶、氧化铝、磷酸钙、活性白土和羟基磷灰石；常用羟基磷灰石;带正电, 稳定范围pH5.5-10, 吸附量1mg/g湿剂 纸层 薄层 3）离子交换层析（ion exchange chromatography） ：交换剂上带电荷，可根据样品的电荷予以分离 a）阳离子交换层析 b）阴离子交换层析 c）离子交换剂的类型：离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换凝胶 d）实验室常用的离子交换剂：阴离子交换剂DEAE-Cellulose、DEAE-Sephadex；阳离子交换剂CM- Cellulose、CM- Sephadex e）离子交换剂的预处理：去杂质；溶胀；除小颗粒；改型 阳离子交换剂： 碱→水→酸→水→平衡 阴离子交换剂： 酸→水→碱→水→平衡 f）柱层析：床体积等于2-5倍束缚样品需要量； 径∶高 = 1∶15 ； 上样量不超过柱体积的10%（*注意上样方法）；洗脱方法有两种——不连续梯度洗脱和连续梯度洗脱；分布收集器收集每管2-3ml g）交换剂后处理：饱和NaCl→水→酸或碱→水→平衡 连续梯度洗脱 梯度混合器 离子交换层析 阳离子交换剂 阴离子交换剂 Anion exchange chromatography 4）凝胶层析（分子筛层析）（gel filtration chromatography）：根据分子量大小予以分离 a）凝胶预处理：凝胶→浸入洗脱液→轻轻搅拌 ↓ 加热90-100℃（水浴加热） b）层析柱准备：φ2.5×100柱； 稠胶灌柱； 2-3个床体积的缓冲液平衡； 流速16-18ml/h c）层析：兰葡聚糖（分子量2×106）验柱并求外水体积（V0）；上样量1-5% ； 恒压洗脱； 流速16-18ml/h d）凝胶后处理：0.5N NaOH+0.5N NaCl处理后4℃保存 长时间不用可采用乙醇脱水保存或低温干燥保存 凝胶过滤层析原理图 Gel filtration chromatography 5