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不同成熟度棉花种子脂肪酶活性测定 指导老师： 玛依拉老师 作 者： 米耶赛.买买提艾力 班 级： 生技102班 学 号： 103135219 前言 棉花是世界上最主要的农作物之一,也是我国重要的经济作物.棉花生产实践表明, 棉花种子成熟度与棉花生产保全苗、齐苗、壮苗有直接关系.成熟度好的种子不仅发芽率高, 更重要的是田间出苗率高, 出苗整齐健壮,即种子活力高.所以, 种子成熟度是反映种子活力的重要内在指标.不同成熟度的棉花种子所含的脂肪酶和它的活性不同,因此选取不同成熟度的棉花种子提取脂肪酶并且测定其活力根据实验结果找出活力较高的棉花种子对以后的农业生产提供依据. 二、材料与方法 2.1 试验材料 2.1.1 棉花种子 棉花惠远710品种 不同采收期吐絮当天、吐后第10天、吐絮后20天、混合收的种子为实验材料.参与本实验的品种是新疆农业大学农学院棉花育种教研室提供. 2.1.2 实验仪器与药品 仪器：高速匀浆机，离心机,冰谷,镊子,剪刀,发芽盒，移液抢，离心机，恒温水溶谷，烧杯，PH测定纸,定容瓶,玻璃棒，三角胶头滴管,电磁搅拌器,双层纱布,烘干箱. 药品 ：升汞，蔗糖,PH试纸，乙酸铜,Twenn-20和橄榄油,EDTA,KCI, MgCI2, DTT,磷酸缓冲液,双氧水,吡啶的溶液,橄榄油,脂肪酸显色剂,乳酸苯酚透明液，蒸馏水,95%酒精,4%聚乙烯醇,橄榄油,底物溶液，氢氧化钠 ，酚酞指示液. 2.2 试验方法 2.2.1 实验处理 选用细沙为发芽床，发芽温度为常温30℃～35℃温度和沙床，共4个处理的，每处理3个重复，每重复120粒种子。 2.2.2 室内标准发芽实验 2.2.2.1 砂床准备 2.2.2.2 种子处理 2.2.2.3 棉花叶子处理 我将发芽第4天的棉花幼苗用于做实验（如图所示）我将长好的子叶拔下来装到空的发芽盒里面.然后把它消毒了以后做实验材料. 第四天发芽的棉花种子 2.2.4 脂肪酶活性测定法 三，结果与分析 五，结论 前言 试验材料与方法 结果与分析 讨论 内容简介 结论 2.2.3 棉花种子脂肪酶的提取 参考Huang[11]的方法,将种子或幼苗蒸馏水洗净后,取两片子叶加入1.0ml含0.6mol/L蔗糖,lmmol/LEDTA10mrnol/LKCI,lmmol/LMgC12,2mmol/LDTT及0.15mmol/LTrieine,pH为7.5的酶提取液,在4度冰浴研磨,匀浆经过滤除去组织碎片,即可直接作为酶的粗提取液测酶活性.在部分实验中,为除去匀浆中本身所含有脂类物质的干扰,将滤液在104g× 10min下离心,弃去浮在表层的脂肪及沉淀物,用上清液部分作为脂肪酶酶源. 电位滴定法 ①按pH计使用说明书进行仪器校正； ②取两个100mL烧杯，分别作为空白A和样品B，分别加入底物溶液4mL和磷酸缓冲液5mL，再于A中加入95％酒精15.00mL，于40℃±0.2℃水浴中预热5min，然后各加1mL酶液，立即混匀计时，准确反应15min后，于B中立即补加15.00mL 95％酒精终止反应取出。 ③在烧杯中加入一转子，置于电磁搅拌器上，边搅拌，边用氢氧化钠标准溶液滴定，至pH10.3，为滴定终点，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。 指示剂滴定法 ①取两个100mL三角瓶，分别作为空白A和样品B，分别加入底物溶液4mL和磷酸缓冲液5mL，再于A中加入95％酒精15.00mL，于40℃±0.2℃水浴中预热5min，然后各加1mL酶液，立即混匀计时，准确反应15min后，于B中立即补加15.00mL 95％酒精终止反应，取出。 ②于A、B瓶中各酚酞两滴，用氢氧化钠标准溶液滴定，直至微红色并保持30s不退色为滴定终点，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。 3.1 两种测定方法对脂肪酶活性的比较 测定脂肪酶活力是我们用了电位滴定法和指示剂滴定 法等两种方法，测定结果如图表（1）所示，从下面图可以看出，电位滴定法和指示剂滴定测定方法的测定结果在数值上有一定差异，不能相互替代。用指示剂滴定法来分别测定棉花种子吐絮当天，第10天，第20天，混合种子的结果比滴定法的结果高，那是因为指示剂滴定法试验过程中，用NaOH滴定生成的脂肪酸,以酚酞作指示剂。滴定NaoH的体积多一点,在棉花脂肪酶的测定中,由于棉子含油分高、棉酚等的干扰,指示剂显色变化缓慢等当点显色突变很难准确把握 棉花种子脂解酶显著的碱性特性。 图表(1）电位滴定法与指