第04口章 蛋白质的共价结构.pptVIP

肽的命名 Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu丝氨酰－甘氨酰－酪氨酰－丙氨酰－亮氨酸（五肽） 肽平面结构特征: 肽键长=1.33Ao，具部分 双键性质，不能自由旋转 肽平面上的六个原子 倾向于共平面，因此肽平面具有刚性 在肽平面中C=O与N–H 或两个C?呈反式排布。 除Pro外，N–C?（?）和C?–C（?）都是单键，可以绕键轴自由旋转，其旋转角度分别用?和?表示，称为二面角（dihedral angle） 准备工作（一）： 样品的分离纯化和纯度鉴定 纯度＞97% 检测蛋白质样品纯度的方法： （1）电泳 （2）层析 （3）N-末端氨基酸的测定 （4）等电点沉淀 （5）纯化至恒定的比活 准备工作（二）： 确定相对分子量 误差10% （1）凝胶过滤 （2）沉降分析法 （3）SDS（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳） 三、蛋白质一级结构的测定 测定的战略：片段重叠法 一级结构是研究高级结构的基础； 从分子水平阐明蛋白质的结构与功能的关系； 为生物进化理论提供依据； 为人工合成蛋白质提供参考。 测定蛋白质一级结构的主要意义： 二硫键的数目和位置 蛋白质的一级结构 (Primary structure) 组成蛋白质的多肽链数目 多肽链的氨基酸顺序 1 测定多肽链的数目 2 拆分多肽链 3 断开多肽链内的二 硫键 4 测定每一肽链的氨 基酸组成 5 鉴定多肽链的N-末端和C-末端 6 裂解多肽链为较小的肽段 7 测定各肽段的氨基酸序列 8 重建完整多肽链的一级结构 9 确定二硫键的位置 相对分子量的确定 待测样品纯度鉴定 97％以上 准备工作 (一) 策略 分子总的相对分子质量 每个亚基的相对分子质量 测定要求 A.纯：97% B.分子量 C.亚基数量 D.测定氨基酸组成； 计算每种氨基酸的个数 E.测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量 1、测定蛋白质分子中多肽链的数目 测定末端AA的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系 确定多肽链的数目 （二）测定步骤 2、多肽链的拆分 多条多肽链组成的蛋白质分子，必须拆分 2. 多肽链的拆离 P171 1).亚基拆分: ①PH改变: PH10 ; PH3 ②强变性剂：脲 （8M）； 盐酸胍（6M） ③ 高浓盐 2).二硫键拆分 氧化: 过甲酸，不再重新生成 -S-S- 还原: DTT；巯基乙醇→ 加碘乙酸等烷基化试剂→封闭SH 烷基化试剂：碘乙酸，碘乙酰胺，环乙烯亚胺 3).肽链分离和鉴定 分离: 层析 电泳 鉴定: SDS；N-末端分析 寡聚蛋白质：多肽链以非共价键连接 血红蛋白（四聚体）、烯醇化酶（二聚体） 8mol/L尿素 6mol/L盐酸胍 多肽链以共价键连接 胰岛素：过甲酸氧化 β-巯基乙醇还原 1).亚基拆分: 2） 二硫键的断裂 几条多肽链通过二硫键交联 8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下 过量的?-巯基乙醇处理 二硫键还原为巯基 烷基化试剂保护巯基，防止重氧化 -S-S-共价交联 肽链的拆分 氧化法 还原法 巯基（-SH）的保护 3. 肽链aa组成的测定： 1)蛋白水解: 酸解法；碱解法； 5.7N恒沸HCL ①Trp100%被破坏 酸解：Pr溶液 105-110℃20-72h ②二硫键解离 ③Asn Gln → Asp Glu ④Ser Thr Tyr Lys部分破坏 2) aa定性和定量： 定性: 纸层析；薄层层析；高压纸电泳 定量：柱层析(离子交换原理) 3、测定各多肽链的AA组成 并计算出氨基酸成分的分子比 4、分析多肽链的N-末端和C-末端 末端氨基酸：N-端A(amino-terminal)、C-端AA 最重要的是N-端AA分析法 ? 二硝基氟苯（DNFB）法 Sanger法：2,4-二硝基氟苯与N-端的游离氨基作用，生成 二硝基苯衍生物（DNP）. 酸性条件下水解，黄色DNP-氨基酸，乙