4第四章 酶的提取与分离纯化幻灯片.pptVIP

第一节 细胞破碎——只对胞内酶 许多酶存在于细胞内。为了提取这些 胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。 细胞壁的主要成分： 细菌：肽聚糖：N-乙酰萄糖胺，N-乙酰 胞壁酸 真菌和酵母：萄聚糖，甘露聚糖 藻类：纤丝状多糖类 细胞破碎的方法： 1）机械破碎法 2）物理破碎法 3）化学破碎法 4）生物法（酶解） 1）超声波：通过剪切力和空穴作用 （30mg蛋白/ml, 30-60sec/次） 2）渗透压变化：高渗（蔗糖，高盐 等）平衡后迅速转入低渗溶液或水中。 3）冻融：反复低温冰冻，室温融化。 (三) 有机溶剂沉淀 在待分离的酶液中加入与水互溶的有机溶剂使溶液介电常数降低，酶蛋白分子间引力增大而相互产生聚集，从而降低溶解度而析出沉淀。 实际操作中常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇和甲醇等。 温度 0℃下操作。有机溶剂先在-15 ℃ ～ - 20℃下预冷，沉淀后立即在低温下离心分离。 pH值：尽可能靠近其等电点。 沉淀后马上用缓冲液溶解，减少有机溶剂浓度。 实验室离心机 温度类型：常温及冷冻 超速离心机均为冷冻型。 使用冷冻离心机时提前降温，预冷离心头，开盖关机。 使用超速离心机时先抽真空。 离心的形式 角式及外摆式：外摆式一般为低速，角式由低速到超速均有。 角式离心机和离心头（转子） 角式离心头要配套，低温使用要预冷，操作注意稳、盖、旋紧。 离心机的大小：台式 离心机操作 平衡、定温、定速、定时。 离心机其它类型 偶联 亲和结合 洗脱 酶纯化效率高，但制备亲和吸附剂较麻烦，贵 广泛用于酶分离纯化、脱盐、测定相对分子质量 离子交换纤维素洗脱条件较温和，酶分离纯化多用 酶分离纯化 成本较低 应用 洗脱液含酶的配基或其他物质 用样品和平衡缓冲液洗脱 常用pH梯度或盐浓度梯度洗脱 洗脱液离子强度比样品液高 洗脱 特点 上样后先洗涤除杂质然后洗脱，柱床要再生 湿凝胶抽气后湿法装柱 纤维素和凝胶类交换剂装柱时先抽气，柱床要再生后再上样 无 操作步骤特殊点 用琼脂糖或纤维素为载体共价结合适当的配基而成亲和吸附剂 葡聚糖凝胶琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶（凝胶网孔内水为固定相） 离子交换凝胶 离子交换纤维素 离子交换树脂 物理吸附剂，如活性氧化铝磷酸钙胶体等 固定相 亲和层析 凝胶层析 离子交换层析 吸附层析 第七节 电泳技术（electrophoresis）在酶分离纯化中的应用 电泳的定义： 带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向移动，这种现象称之为电泳(electrophoresis，简称EP)。 电泳技术就是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行分离的一类实验技术。 1、聚丙烯酰胺凝胶（PAG） PAG由丙烯酰胺（ arc，单体）和甲叉双丙烯酰胺（ bis，双体，交联剂）在催化剂作用下聚合而成。 arc浓度：凝胶的孔径大小 arc和bis的比例：凝胶的强度 催化剂用量：聚合时间 一、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 2、PAGE的应用类型 常规PAGE 浓度梯度PAGE SDS不连续PAGE（用于一般分析分离纯化） 连续PAGE（同上） （用于测定Pr相对分子质量和分离纯化） （用于测定Pr单体相对分子质量和双向电泳） √ √ √ 3、不连续PAGE的特性和分离Pr的效应 （1）三个不连续 凝胶浓度不连续； pH值不连续； 缓冲液不连续。 （2）三种效应 浓缩效应； 电荷效应； 分子筛效应。 三足离心机 中 小 大 1、差速离心 采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉降速度的颗粒先后分离的方法。 应用范围:大小和密度有较大差别的颗粒。 2、密度梯度离心 在离心管中用5~60%的蔗糖溶液，形成由管底到液面逐渐降低的梯度，将样品放在密度梯度溶液的表面，经过离心，不同大小、具有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度溶液中形成若干条不连续的区带。 梯度介质：蔗糖密度梯度系统 密度梯度的制备：密度梯度混合器 3、等密度梯度离心 当欲分离的不同颗粒的密度范围处于离心介质的密度范围时，在离心力的作用下，不同浮力密度的颗粒一直移动到与他们各自的浮力密度恰好相等的位置，形成区带。 常用的离心介质：铯盐，如CsCl，Cs2SO4，CsBr 先把一定浓度的铯盐溶液与样品液混合均匀，也可将一定量的铯盐加到样品液中使之溶解。 在选定的离心力作用下，经过足够时间的离心分离。 铯盐在离心力的作用下，在离心力场中沉降，自动形成密度梯度。 样品中不同浮力密度的颗粒在其各