总RNA的提取与电泳课件.ppt

* RNA的提取与电泳 * RNA的提取与电泳 实 验 三 动物组织总RNA的提取与电泳 四川大学基础医学与法医学院生物化学与分子生物学 廖英 1. 实验目的和要求 2. 相关基础知识 3. 实验方法、步骤和注意事项 一. 实验目的和要求 掌握RNA制备以及常用鉴定方法的原理、操作步骤、注意事项和技术关键。 二. 相关基础知识 1. RNA的种类和作用 　 细胞内的RNA主要是 rRNA、tRNA及mRNA和小分子RNA 。rRNA含量最丰富，由2８S、18S、5.8S和5S几类组成。mRNA种类繁多，分子量从数百至数千碱基不等。 RNA是基因表达过程中非常重要的生物分子，如mRNA, 它携带了DNA的全部编码信息。RNA的分离是研究基因功能的重要基础之一，在分子生物学中占有重要的地位。 　　 2. 应用 总RNA制备在分子克隆中有广泛应用，可用于： 1 Northern blotting 2 通过 Oligo (dT) 制备 mRNA 3 通过反转录聚合酶链反应（RT-PCR）建立 　　cDNA文库 4 用于消减杂交和消减文库的构建，筛选差异 　　表达基因 5 体外蛋白质的生物合成 苯酚法：用SDS变性蛋白并抑制RNase活性，经多次酚/氯仿抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用NaAC和乙醇沉淀RNA； 胍盐法：用异硫氰酸胍或盐酸胍和?-巯基乙醇变性蛋白，并抑制RNase的活性，经酚氯仿抽提后再沉淀； 氯化锂沉淀法：因为锂在在一定pH下能使RNA相对特异地沉淀，但容易使小分子RNA损失，而且残留的锂离子对mRNA有抑制作用。 3. 常用方法 已有多种较为成熟的分离总RNA的方法，常用的有3种: 本实验采用胍盐法。 其原理是：在解偶联剂异硫氰酸胍作用下，蛋 　　　　　白质与RNA解偶联；利用蛋白质为 　　　　　酚–氯仿–异戊醇变性后可除去 ； 　　　　　而RNA不溶于50%异丙醇析出得到分 　　　　　离纯化。 ４．RNA的检测 RNA的检测采用琼脂糖凝胶电泳，分为非变性电泳和变性电泳。 紫外分光光度法分析所制备RNA的浓度及纯度 。 由于RNA分子是单链核酸分子，它自身可以回折形成局部双链的二级结构及更复杂的分子状态，所以通过一般传统的琼脂塘凝胶电泳难以得到依赖于分子量的电泳分离条带。 为此电泳上样前将样品于65℃加热变性5分钟，使RNA分子的二级结构充分打开，并且在琼脂糖凝胶中加入适量的甲醛，可保证RNA分子在电泳过程中持续保持单链状态。 如此，总RAN样品便在统一构象下在琼脂糖凝胶上得到依赖于分子量的逐级分离条带。 　　可通过紫外分光光度法分析所制备RNA 的浓度及纯度 。 　 浓度： O.D260 = 1 时， RNA 为 40 μg / ml 　纯度： O.D260 / O.D280 ≈ 2.0 　　 〈 1.75 说明存在蛋白质污染 　　〉2.0 说明存在酚等有机溶液污染 三. 实验方法、步骤和注意事项 兔肝匀浆液0.5ml至eppendorf中 50μl NaAc 颠倒混匀 0.5ml酚氯仿异戊醇，混匀 置冰浴中20min. 离心(10000rpm,20min.) 吸出水相 置-20℃冰箱中RNA使沉淀 (1 hr) 75℅乙醇１ml，混匀 离心(10000rpm,10min.) 溶解之RNA 离心(10000rpm,10min.) 沉淀 沉淀 50μl dH2O (DEPC) 加入等体积异丙醇 水相(RNA) 原点 28s 18s 5s rRNA 1%琼脂糖电泳 ①制胶 ②20μl样品液→ ７0℃，２～３分钟→冷至室温 　→加４μl loading buffer ③点样 ④电泳（电压150V， 时间 30分钟） 由于RNase极稳定，所以，在操作RNA时，要格外仔细，以防RNA被降解。在提取RNA之前，必须对所用器皿进行RNase灭活处理。如用180oC干烤8小时以上处理玻璃器皿，或用0.1?的二乙酯焦碳酸 (DEPC)的水溶液浸泡玻璃器皿和其它用品。所用水以及相关的缓冲液也需要用0.1? DEPC水处理。 注意事项 １、抑制内源和外源RNase活性