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基因工程实验 实验讲义水产与生命学院2010 年12 月目录基因工程实验注意事项............................................................................2实验一 总RNA的提取..............................................................................3实验二cDNA第一条链的合成..................................................................4实验三 重组DNA 的制备（设计性实验）............................................5实验四 碱变性法提取质粒DNA（小规模）.........................................8实验五 提取中华绒螯蟹肌肉中基因组DNA.......................................10实验六 利用RACE法克隆基因（设计性实验）..................................111基因工程实验注意事项1. 上实验课不能迟到，分小组进行实验。2. 课前要提前预习实验内容，弄清实验设计的原理，理清实验顺序。3. 由于实验内容多，时间短，多数实验需要同时或穿插进行，做好统筹安排。4. 实验的每一步都要详细的记录操作内容、时间、步骤、结果等。5. 对任何自己不熟悉的实验仪器（尤其是移液器）都不要随意操作。在操作过程中发现任何意外的现象都要及时向任课老师汇报。6. 在实验室内不能大声喧哗，，严格遵守课堂纪律。7. 在实验操作过程中注意一定要穿实验服，带手套，制造的任何垃圾都要丢到垃圾筐里，严禁随地投弃。特别注意对废弃细菌的杀灭和有毒垃圾的定点投放。8. 实验时损坏的任何物品都要及时申报。9. 实验结束后要把用过的器皿清洗干净并归放整齐、清点数目，向老师汇报征得同意后方可离开实验室。10.写作实验报告或实验论文一定要纹理通顺、逻辑清晰、图标说明详细、讨论分析透彻（包括操作的失误）。2实验一 总RNA的提取【实验目的】1. 掌握一种RNA提取的方法。【实验原理】TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中，当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机相主要为DNA和蛋白质。【实验药品与器材】匀浆器，微量移液器，微量恒温器，1.5mL离心管，冷冻离心机，Trizol试剂，氯仿，异丙醇，75％酒精，DEPC水，琼脂糖，电泳仪，分光光度计。【步骤】取样：将罗氏沼虾活体解剖，迅速取卵巢组织约100mg于1.5ml的离心管中，置液氮罐冷冻备用。用Trizol试剂提取总RNA：1. 每个离心管加1mL Trizol 试剂于冰上碾碎组织2. 碾碎后在30℃恒温箱中保存5 分钟3. 每1mL Trizol 加0.2mL 氯仿，用手震荡15 秒，放30℃恒温箱中3 分钟4. 离心：低温4℃，12000g，15 分钟5. 取上层水相到另一干净离心管6. 每1mL Trizol 加0.5mL 异丙醇，30℃恒温箱中10 分钟7. 离心：低温4℃，12000g，10 分钟8. 清洗RNA：移去上清，每1mL TRIzol 加入1mL 75%酒精，用移液枪反复吹洗打散9. 离心：低温4℃，7500g，5 分钟10. 乙醇析出，可见白色沉淀于管壁，自然干燥15 分钟11. 用30μL DEPC 直至完全溶解，然后放置于-80℃冰箱保存。12. 1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA 质量13. 测OD 值3实验二cDNA第一条链的合成【实验目的】掌握cDNA合成的方法，为后续PCR实验做准备。【原理】所有合成cDNA 第一链的方法都要用依赖于RNA 的DNA 聚合酶(反转录酶)来催化反应。【步骤】1)Oligo dT Primer(50μM) 1 μldNTP Mixture(10mM each) 1 μlTotal RNA(1000ng/μl) 1 μlRnase free dH2O 7 μl反应条件：65℃ 5min ,急冷 2min2)上述变性、退火后反应液 10μl5×PrimeScript Buffer 4μlRNase Inhibitor(40U/μl) 0.5μlPrimeScript Rtase 1μlRNase Free dH2O 4.5μl总共 20μl反应条件：