7,8 的基因的制备和基因克隆的筛选.ppt

基因工程 田长恩 Tel:How to amplify a target gene ? Amplification of a target gene with PCR if the sequence is known. 7 目的基因的制备 7.1 直接分离 7.2 构建基因组文库分离 7.3 构建cDNA基因文库分离 7.4 利用聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因 7.5 基因的化学合成(自学) 8 基因克隆的筛选策略 建库后，首要任务是筛选含目的基因的克隆子。 依据待分离基因或其产品的有关特性，如序列、功能、染色体上的位置和mRNA等，建立相应的方法。 8.1 根据功能筛选 8.2 根据序列筛选 8.3 差别杂交及减法杂交法 8.4 差别显示法 8.5 功能结合法 8.6 DNA 插入诱变法 8.7 基因定位克隆法 8.8 分子间相互作用克隆法 IQM1 possesses an IQ motif and may be a Ca2+-independent CaMBP Yeast two hybrid assay on IQM1 and CaM5 BiFC assay between IQM1 and CaM2 最简单的淘选程序，是将噬菌体展示肽库与包被有靶分子的平板（或磁珠）共温育，先洗去未结合噬菌体，然后洗脱特异性结合的噬菌体。被洗脱的噬菌体进行扩增，然后再进行下一轮的结合/扩增循环，以富集那些可结合序列。经3-4轮淘选后，通过DNA测序对每个可结合克隆进行定性。 1 名词解释 SSH、RDA、DDRT-PCR、ESTs、酵母双杂交、cDNA文库、基因组文库 2 简要回答问题 1）简述cDNA文库构建的原理与步骤 2）简述基因组文库构建的原理与步骤 3）简述酵母双杂交的原理与步骤 3 分析讨论 试述分离和筛选目的基因的主要方法和原理. 8.5.2 T-DNA标签法 T-DNA是根癌农杆菌Ti质粒中的一段特殊序列，当根瘤农杆菌感染植物细胞后，T-DNA便会转移到植物细胞，并通过其两端的25 bp的同向重复序列，随机整合到植物基因组。如果T-DNA整合到一个功能基因内部或其邻近位置，则可能导致该基因失活或产生突变。通过T-DNA上的标记基因（如卡那霉素抗性基因）检测出突变位置，得到与T-DNA相连的DNA片段。再以此DNA片段制备探针筛选野生型基因组DNA文库，就可得到与突变相应的完整基因。因此，T-DNA是高等植物中一种非常有效的分子标签。 8.6 基因定位克隆法 基因定位克隆（positional cloning）又叫作图克隆（map-based cloning）、候选基因克隆（candidate gene cloning），是人类或植物基因的克隆中常用方法，主要根据目的基因在基因组上的位置特性而不是编码产物来克隆基因。 基本步骤: 定位 确定探针 染色体步移逼近目的基因 克隆目的基因，最后根据测序、定点突变、转基因和基因敲除等方法确定目的基因的功能。 必要条件：构建含大片段DNA的基因组文库，如YAC；有可用的与目的基因紧密连锁的DNA分子标记；有生物体基因组高密度RFLP或RAPD分子标记图谱。 8.6.1 染色体步查法（chromosome walking） 首先以已知基因作探针筛选到A片段，然后以A片段为探针筛选出B片段，依此类推，最终获得目的基因片段。 8.8 大分子间相互作用克隆法 某些蛋白质分子往往需要与其他蛋白质分子相互作用才能 具有生物学效应。因此，利用已知蛋白质分子，能够找出与其相互作用的未知蛋白质分子，并进而克隆其相应的cDNA。 8.8.1 酵母双杂交体系 酵母双杂交体系（two-hybrid system），能有效地分离与一已知蛋白质相互作用蛋白的编码基因，广泛用于真核基因的表达与调控、细胞粘合因子间的相互作用、信号传导通路以及细胞周期与分化、反式因子的鉴定