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Western Blot 原理和操作方法 陈宇 ?? 发表于2009年08月03日 16:14 阅读(4) 评论(1) 分类： 个人日记 举报 蛋白质的样品制备：? 　　蛋白质的样品制备是Western?Blotting的第一步，样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题：? 　　1：在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。? 　　2：选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多肽的溶液。? 　　3：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。? 　　4：防止蛋白质在样品处理过程中的人为的修饰，制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰（建议加入合适的蛋白酶抑制剂）? 　　5：样品建议分装成合适的量，然后冷冻干燥或直接以液体状态置-80℃中保存，但要注意不要反复冻融。? 　　一：准备工作：? 　　一个水浴箱，一台超声装置，组织匀浆器? 　　二：需要的溶液：? 　　裂解液?Laemmli样品缓冲液? 　　三：操作步骤：? 　　1)培养细胞蛋白质样品的制备：? 　　1：胰酶酶解后裂解：? 　　细胞培养至80%左右密度时，以含0.05%胰蛋白酶消化，细胞经预冷的PBS漂洗3次，离心收集在离心管中，加入450μl裂解液反复吹打。? 　　2：皿上直接裂解：? 细胞培养至80%左右密度时，细胞经预冷的PBS漂洗3次，加入450μl裂解液，细胞刮刀收集，用移液器转移至离心管中，反复吹打。? 　　以上所得的样品最终用超声细胞破碎仪超声处理，超声时为5S，间歇时间为10S，功率为100-120W至溶液清澈无粘稠为止，处理过程在水浴中进行，后4℃25000g离心1小时取上清或以最大强度超声4次，每次15-30S，在每次超声步骤之间将样品转置水浴中15S，加入Laemmli?样品缓冲液（视蛋白样品浓度，以1：1或1：2的比例混合），强力混匀，样品置100℃水浴箱里水浴加热3-5分钟，10000g离心10分钟，取出清液，将其移入另一洁净试管中，至此，电泳样品已准备就绪。（样品可立即使用也可以分装冻存，-20℃存放的样品可稳定保持数月）? 　　2)组织样品的制备：? 　　手术切除的组织块迅速置于预冷的0.95生理盐水中，漂洗数次，以清洁表面的血迹，将组织称量后切成几个较小的组织块放入机戒组织匀浆器中，按组织净重，裂解液=1：10的比例，加入相应体积的裂解液进行匀浆，离心收集上清（如有粘稠物可超声处理，具体方法见细胞培养的样品制备，也可以冷冻干燥降解核酸后，将冻干的蛋白质样品溶解在适当的上样?buffer中，混匀后静置3小时使样品中的蛋白质充分的溶解，有5分钟即可，4度离心收集。）加入Laemmli样品缓冲液（视蛋白样品浓度，以1：1或1：2的比例混合）强力混匀，样品置100度的水浴箱水浴加热3-5分钟，10000g离心10分钟，取上清液，将其转入另一洁净的试管中，至此，电泳样品已准备就绪（样品即可立即使用也可也可以分装冻存，-20℃存放的样品可稳定保持数月。）? 附：? 一：裂解液的制备：? 组织裂解液（全细胞蛋提取）： 1：Tris-HCL?50mmoL/L?PH?7.4? 2:?Nacl?150?mmoL/L? 3:?去氧胆酸钠?0.25%? 4：NP-40或Triton-x-100?1%? 5:?EDTA?1?mmoL/L? 6：?PMSF?1?mmoL/L? 7：?Aprotinin?1μg/ml? 8:?leupeptin?1μg/ml? 9:?pepstain?1μg/ml? 其中:7,8,9作用不持久，要使用前加入。 细胞裂解液： 1：NP-40裂解体系：　 150?mmoL/L?Nacl? 1.0%NP-40或Triton-x-100?? 50?mmoL/L?Tris(PH8.0)? 2：RIPA裂解体系： 150?mmoL/L?Nacl? 1.0%NP-40或Triton-x-100? 0.5%脱氧胆酸钠? 0.1%SDS? 50?mmoL/L?Tris(?ph8.0)? 二：Laemmli?样品缓冲液配置（1*SDS样品缓冲液）? 50?mmoL/L?Tris-HCL?（PH8.0）? 100?mmoL/L?DTT? 2%?SDS? 0.1%?溴酚蓝? 10%?甘油? 此液可以配置成不同的储存液，根据蛋白浓度而定，40C长期保存，用时临时与蛋白液按比例混合，其中DTT应临时加入，以防降解。? ? 蛋白质定量? 1)Bradford法:? 检测原理:?Bradford与蛋白质四级结构,特殊氨基酸结合,由棕色变成蓝色,595nm检测