精选课件第三章 高效液相色谱法 A.ppt

第三章 高效液相色谱法 第一节 高效液相色谱法的特点 ? 以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法 ? 引入气相色谱法的理论，在技术上采用新型高效的固定相、高压输液泵、梯度洗脱技术以及各种高灵敏度的检测器，实现了分析速度快、分离效率高和操作自动化 一、经典液相柱色谱法与高效液相色谱法的比较 二、气相色谱法与高效液相色谱法的比较 相同：兼具分离和分析功能， 均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别、 流动相的差别、 操作条件差别 分析对象的差异 GC ? 能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品 ? 高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型 及高聚物的样品不可检测 ? 占有机物的20% HPLC ? 溶解后能制成溶液的样品 ? 不受样品挥发性和热稳定性的限制 ? 分子量大、难气化、热稳定性差及 高分子 和离子型样品均可检测 ?用途广泛，占有机物的80% 流动相差别 GC： ? 流动相为惰性气体 ? 组分与流动相无亲合作用力 只与固定相作用 流动相差别（续） HPLC：流动相为液体 ? 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用 ? 流动相种类较多，选择余地广 ? 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用 ? 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选择性 操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小） 三、高效液相色谱法的特点 （1）高压：供液压力和进样压力可达5×104kPa （2）高速: 流动相流速加快 （3）高效: 柱效可达3万塔板/米以上。 （4）高灵敏度:10-16～10-9克 （5）选择性高：可以通过流动相的控制来改善分离过程的选择性 （6）应用范围广 四、 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素 （一）塔板理论 （二）速率理论 HPLC ? H = He + Hd + Hs + Hmm + Hsm ? 1、涡流扩散项He He＝ A = 2λdp 2、分子扩散项Hd ? 样品在色谱柱中滞留的时间愈长，色谱谱带的分子扩散也愈严重。 ? Dm≈10-5 cm2/s（比在气体中要小4—5个数量级），所以在液相色谱中，纵向分子扩散项实际上可以忽略 3、传质阻力项 (1)固定相传质阻力项Hs： (2)流动相传质阻力项： ①流动的流动相的传质阻力Hmm ②滞留的流动相的传质阻力Hsm Van Deemter方程 分子扩散和传质阻力对板高的贡献 固定相粒度大小对板高的影响 （三）影响谱带展宽的其他因素 柱外效应 第二节 高效液相色谱仪 一、贮液和脱气装置 1 储液罐 ?材质：玻璃、不锈钢、氟塑料或特种塑料聚醚醚酮（PEEK） ?容积：0.5~2.0L ?放置位置：高于泵体，保持一定的输 ?静压差 ? 注意：密封、过滤 2、流动相----过滤、脱气 流动相过滤的目的 过滤去除可能存在的微小固体颗粒，保护色谱高压泵和色谱柱 流动相过滤方法 流动相脱气的目的 使色谱泵的输液准确 输液均匀准确，并且脉动减小 保留时间及色谱峰面积的重现性提高 提高检测的性能 防止气泡引起的尖峰 基线稳定，信噪比增加 溶剂的紫外吸收本底降低 保护色谱柱 减少死体积 防止填料的氧化 常用的脱气方法有： ①吹氦脱气法： 原理：利用氦气在液体中的溶解度比空气低。 特点：效果好，适合所有溶剂，但成本高，使用较少 ②加热回留法：脱气效果也比较好 ③抽真空脱气法： 特点：可以一次完成过滤和脱气任务 注意：抽真空会引起混合溶剂组分的变化，适合单一溶剂体系 ④超声波脱气法 简单，但效果不理想 常用的脱气方法（续） ⑤在线真空脱气法 把真空脱气装置串接到储液系统，结合膜过滤器可以实现流动相的连续在线真空脱气。 二、高压输液系统 高压输液泵性能： ①泵体材料耐化学腐蚀 ②能在高压下连续工作 ③ 输液流量范围宽