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冬虫夏草子座发育前后转录组基因文库的构建以及表达差异的研究 专业：微生物学 导师：谢放 副教授 姓名：常黎明 1、转录组的特点及意义 What？ Why？ How？ 转录组是指在某一生理条件下某物种产生的所有转录本的集合。 广义的转录组主要包括信使 RNA（mRNA）、非编码 RNA、转运 RNA（t RNA）及核糖体 RNA（r RNA）。 狭义的转录组主要指信使 RNA（mRNA）。 与基因组是的静态不同，转录组可以随物种自身发育或外部环境条件的变化而有所转变，同一物种在不同发育阶段或不同环境中其基因表达情况存在很大差异，具有很强的时间和空间特性。转录水平的变化是生物基因组与外部物理特征的动态联系，可反映生物个体在某一发育或生理阶段所有基因的表达水平。 因此，掌握了特定生物转录水平的变化，就可以深入了解其生命活动特征和调控机制。 转录组学研究内容主要包括以下几个方面： 新基因的预测 基因结构分析（SNP分析、转录组中存在的可变剪接分析、基因结构优化等） 物种差异表达基因注释和富集分析 差异表达基因表达蛋白的二级结构预测 UTR（untranslated region）分析 2、研究背景 冬虫夏草是由冬虫夏草菌侵染青藏高原高山草甸土中的鳞翅目蝙蝠蛾（主要为钩蝠蛾属 Thitarodes Viette）幼虫并在虫体内生长产生子座而形成的幼虫尸体与真菌的复合体。 作为一种未能实现人工化栽培的名贵药用真菌，冬虫夏草相关的研究都只是集中在菌种的分离鉴定、寄主昆虫种类的确定和人工繁殖、菌株培养特性、代谢产物分离分析及活性成分药理作用、冬虫夏草菌有性发育及其相关基因的研究等方面。特别对于冬虫夏草菌有性发育及其相关基因的研究一直是近年来国内为研究的热点。 2、研究背景 由于冬虫夏草菌特殊的生境和本身的复杂性导致对其系统全面的研究面临困难，因而让其在人工条件下长出子座遇到巨大的挑战，况且到底哪种或哪几种菌是其正确的无性型学界众说风云。因此对于冬虫夏草子座有性发育的研究一般都停留在天然冬虫夏草的研究。冬虫夏草菌能够长出子座完成有性生殖过程说明它的基因组中的某些基因一定发生着时空表达，到底是某些基因的表达量的变化引起了有性生殖还是冬虫夏草菌生长到某一个阶段后一些基因在时间或空间的诱导下突然表达亦或是二者共同作用；这一有性发育过程中受到哪些因素的影响以及怎样的影响到目前都没有确定的答案。 3、目的和意义 通过对冬虫夏草子座发育前后转录组基因文库的表达差异研究旨在： （1）构建冬虫夏草长出子座的实验体系； （2）从分子层面揭示冬虫夏草子座发育的原因； （3）用生物信息学的方式预测冬虫夏草有性生殖的关键基因； （4）发掘冬虫夏草有性发育过程中未注释的基因区和新的转录本； （5）通过对子座发育前后差异表达基因以及转录本的功能注释和功能富集分析，为后续的生物信息学研究提供分子水平的依据。 4、实验流程 冬虫夏草菌的活化 批量接种 菌种营养生长培养 处理组：低温诱导使其进入子实体发育阶段 末端修复、3’端加Poly（A） 连接接头 取样 样品总RNA的提取及纯度检测 对照组：保持营养生长 SMART cDNA Library Construction Kit试剂盒构建cDNA文库 PCR富集 文库质控 上机测序获得原始测序数据 4.1、样品培养和获取 将保藏的以前长出过子座的菌种经活化后重新接种到锥形瓶在培养箱中培养，经过2-3个月开始低温诱导使其长出子座。在无菌环境中以子实体发育启动前正常营养生长的菌落和萌发一周左右的子实体原基作为对照组，用手术刀小心切取菌落。各3个生物学重复。 4.2、提取总RNA 用RNA提取试剂盒提取Total RNA，并进行样品的纯度、浓度和完整性检测，以保证使用合格的样品进行转录组测序。 4、实验流程 4.3、 mRNA的富集以及cDNA文库的构建 将上述检测合格后的总RNA用带有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，接着以mRNA为模板用SMART cDNA Library Construction Kit试剂盒构建高质量的cDNA文库，并进行末端修复、3’端加Poly（A）和加上连接接头，然后将cDNA文库进行PCR富集，最后通过QIAquick PCR Purification Kit试剂盒纯化纯化PCR产物，取一部分保存到-80℃保藏。 文库构建完成后，分别使用Qubit 2.0和Agilent 2100对文库的浓度和Insert Size进行检测，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量。 4、实验流程 4.4、上机测序 库检合格后，用HiSeq2500进行高通量测序，测序读长为PE