锰离子对柠檬酸积累的抑制作用[精选].docVIP

有机酸工艺学作业 学院：生物工程学院 专业：生物化工 学号 姓名：冀 蓉 在有着降低的磷酸果糖激酶的柠檬酸控制的黑曲霉突变体中锰离子对柠檬酸积累的抑制作用 有着降低的碳水化合物代谢的柠檬酸控制的黑曲霉突变菌株（cic突变株）在含有5 %（重量/体积）柠檬酸盐的基质中比亲本更快生长。该突变体耐受一个比亲本更高的细胞内柠檬酸浓度。突变体（cic-713）含有的磷酸果糖激酶活性明显对柠檬酸不太敏感比亲本中的酶。当这种突变体在柠檬酸积累条件下生长时，产酸对Mn2+ 的抑制作用远没亲本那么敏感。cic突变株中的一些也表现出改变的NADP-异柠檬酸脱氢酶的柠檬酸抑制作用。 经由丝状真菌黑曲霉的大量柠檬酸的积累众所周知取决于各种环境因素，其中营养培养基中的Mn2+ 水平起着关键的作用。只有当Mn2+ 浓度低于0.02 mM （不影响生长速率和产量）时，柠檬酸积累大量（17）。 一个关于锰的影响的生化解释最近已经被提出。Mn2+ 不足导致蛋白质流通量的增加，这最终导致一个高的NH4+ 细胞内浓度（7，9）；这个水平的NH4+ 能抵消经由柠檬酸（4，5）的磷酸果糖激酶的抑制作用，从而保证一个高的葡萄糖分解率通过果糖二磷酸途径，这对于柠檬酸积累（17）是必要的。 根据这个模型，Mn2+ 不足对于用柠檬酸消除糖酵解的反馈抑制基本上是必须的。如果这个模型是正确的，那么缺乏磷酸果糖激酶的柠檬酸抑制作用的突变株甚至Mn2+ 存在应该也能积累柠檬酸。 为了检验这个假说，黑曲霉B 60（7）被繁殖在马铃薯葡萄糖琼脂中7天，并且收获分生孢子，稀释在含有0.1 %（重量/体积）吐温80的无菌水中到一个最终浓度2×106个分生孢子每毫升，并且大力摇晃破坏团块。10 ml该悬液然后被放置在一个开放的培养皿中在紫外线杀菌灯下面14 cm并且磁力搅拌5 min。随后，悬液被用铝箔遮盖1 h并且用于潜在突变体的筛选。它们的鉴定是基于假设缺乏磷酸果糖激酶的柠檬酸控制的突变体在含柠檬酸的蔗糖培养基上生长更快，例如下面所讨论的。由于这个原因，经稀释，诱变的分生孢子悬浮液被镀在含有20 %（重量/体积）蔗糖和5 %（重量/体积）柠檬酸作为碳源的固体培养基上。其他无机营养物和氮源基本上被用在柠檬酸生产培养基中（8），除了用H2SO4 将pH调整到3.5。牛胆汁（0.5 %[重量/体积]）被添加到培养基限制增长小，定义的菌落（15）。增长最快的菌落被认为较小影响碳水化合物的分解通过柠檬酸并且因此被选中作进一步的分析。通过这种方法，几千个黑曲霉B 60菌落的筛选允许检测出20到30个潜在的突变体，这些突变体与亲本相比在蔗糖和柠檬酸面前呈现出一个明显减少的增长滞后时间。为了淘汰吸收缺陷突变体，所有的菌落被检查在仅含柠檬酸或葡萄糖作为碳源的培养基上的生长。没有一个突变体呈现出形态学改变。十二个突变体在几次转种后稳定并且被用于做进一步调查。 亲本菌株和假定的突变体，它们被期望通过柠檬酸不敏感的碳水化合物的分解代谢（cic）特征化，在柠檬酸非累积型培养基中生长40 h。收获菌丝并且用先前所述的超声波降解法使其均质在50 mM含1 mM EDTA，5 mM 2-巯基乙醇和20 %（重量/体积）甘油的咪唑缓冲液（pH 7.8）中。从细胞抽提物中纯化磷酸果糖激酶（EC 2.7.1.11）并测定如所描述的其他一样。当所有的12个稳定突变体的磷酸果糖激酶被研究关于柠檬酸的抑制作用时，没有完整的柠檬酸不敏感酶可以在任何cic突变体中被发现。有完全柠檬酸不敏感磷酸果糖激酶的突变体不能被分离是可能的。然而在两个菌株即cic-713和cic-1中，酶比亲本菌株的酶对生理浓度的柠檬酸盐（1到3 mM；图1 ）较不敏感。当柠檬酸影响的研究与培养基6-磷酸果糖浓度（图2）有关时，突变体cic-713在柠檬酸存在时表现出的动力学出现复杂；直到浓度为1.5 mM 6-磷酸果糖，柠檬酸几乎没有影响，并且它只有在 6-磷酸果糖浓度高于2 mM抑制。由于黑曲霉中细胞内6-磷酸果糖的浓度低于1.5 mM ，该突变体表现出含有磷酸果糖激酶，这种酶在生理培养基条件下对柠檬酸不敏感。 黑曲霉中葡萄糖分解代谢的柠檬酸抑制作用只有在磷酸果糖激酶水平不发挥作用。 图1 B 60亲本（△）和它的cic突变体（○，cic-7/3；●，cic-6/3；▲，cic-1；■，cic-7/1）的磷酸果糖激酶的柠檬酸抑制作用。酶用如前所述的亲和层析法纯化。光学试验要求的辅助酶在用于去除硫酸铵前透析，否则会干扰酶的柠檬酸抑制作用的研究。活力是给定的没有柠檬酸时的活力的百分比。各种