黄连解毒汤对2型糖尿病大鼠靶组织葡萄糖转运子4的影响.docVIP

黄连解毒汤对2型糖尿病大鼠靶组织葡萄糖转运子4的影响 【关键词】 2型糖尿病; 葡萄糖转运蛋白; 胰岛素; 空腹血糖 　　黄连解毒汤（Huanglian Jiedu Decoction, HLJDD）出自唐代名医王焘之《外台秘要》，是清热解毒的代表方，由黄连、黄芩、黄柏和栀子组成，传统上临床主要用于治疗相当于热毒证的感染性疾病。而最近世界权威杂志相继报道黄连解毒汤中栀子提取物京尼平［1］和黄连提取物黄连素［2］均能有效治疗糖尿病。本研究所的前期研究也证明，黄连解毒汤具有降血糖，调血脂的功效［3~5］，为了进一步深入探讨其治疗2型糖尿病的机制，本实验观察了黄连解毒汤对2型糖尿病大鼠脂肪和肌肉组织胰岛素信号转导通路中葡萄糖转运蛋白4（glucose transporter 4, GLUT4）表达及转位的影响，旨在探讨该方改善胰岛素抵抗和防治2型糖尿病的作用机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验动物及饲料 雄性健康Wistar大鼠，约2月龄，200～220 g，清洁级，购于湖北省实验动物研究中心。基础饲料购于同济医学院实验动物中心，高脂高热量饲料按配方（蔗糖∶猪油∶奶粉∶鸡蛋∶基础饲料＝30∶20∶4∶2∶63）配制。 　　1.2 药物及试剂 黄连解毒汤，由黄连、黄芩、黄柏和栀子按3∶2∶2∶3的比例组成，其药材购于武汉同济医院，按吴洪元等［6］报道的方法煎煮取汁，浓缩成浸膏（1 g浸膏相当于1.5 g黄连解毒汤生药），以薄层扫描方法测得其所含小檗碱为27 mg/g。临用前以含0.5％羧甲基纤维素的PBS溶液（pH 7.4）配制成含小檗碱9.375 g/L的混悬液。阿司匹林（aspirin, ASP），石家庄神威药业股份有限公司产品，临用前以含0.5％羧甲基纤维素的PBS溶液（pH 7.4）配制成含阿司匹林12 g/L［7］的混悬液；链脲佐菌素（streptozotocin, STZ），Sigma公司产品；胰岛素放免试剂盒，北方生物技术研究所产品；蛋白测定试剂盒，南京建成生物工程研究所产品；蛋白Marker，Fermentas Life Science公司产品；单克隆GLUT4抗体，Ramp;D公司产品；βactin单克隆抗体，Lab Vision公司产品；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG，北京中杉金桥生物技术有限公司产品；增强化学发光法（enhanced chemiluminescence, ECL）试剂盒，Pierce公司产品。 　　1.3 动物分组及处理 动物先适应性喂养2周，随机分为正常对照组和造模组，造模组经尾静脉注射STZ（30 mg/kg）后，用基础饲料喂养2周，然后作口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test, OGTT)，筛选糖耐量异常者随机分组。HLJDD组：按剂量10 ml/kg体质量给大鼠灌服上述黄连解毒汤混悬液，每日8：30～9：30灌胃1次（以下各组灌胃药液容积及灌胃时间与此同）；ASP组：灌上述阿司匹林混悬液；模型组：灌上述含0.5％羧甲基纤维素的PBS溶液。以上3组在治疗期间喂以高脂高热量饲料；正常对照组不予任何干预。均喂养10周，末次给药后禁食12 h作OGTT，配制40％葡萄糖水按2.2 g/kg剂量灌胃，用剪尾的方法在灌胃前及灌胃后30、60和120 min从尾静脉采血，检测空腹血糖值（fasting blood glucose, FBG）及血清胰岛素（fasting serum insulin, FINS）的含量。OGTT结束后，继续喂养1周，禁食12 h后用50 mg/kg戊巴比妥腹腔注射麻醉，取一侧附睾旁脂肪和后肢骨骼肌，然后从门静脉推注胰岛素（8 U/kg），注射后4 min取另一侧附睾旁脂肪组织和后肢肌肉组织［8］，迅速冻存于液氮中，24 h后置于－80 ℃冰箱以待测GLUT4的蛋白表达量。 　　1.4 生化指标的检测 血糖用葡萄糖氧化酶法检测，空腹血清胰岛素用放免法检测，均参照说明书进行。 　　1.5 GLUT4的蛋白表达的检测 参考Klip的方法［9］提取膜蛋白。用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度后取各组样品25 μg蛋白质，以12％的SDSPAGE胶分离蛋白。然后采用湿转法（200 mA, 3 h）［10］将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。再用含5%脱脂奶粉的TBST（含0.1％ Tween 20）室温下封闭2 h后加入一抗（1∶2 000），4 ℃过夜，洗膜后加辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶3 000），室温轻摇2 h，充分洗涤后用ECL显影曝光，洗片后用激光扫描仪测各条带光密度。 　　1.6 统计学方法 实验数据以x±s表示，采用SPSS 11.5软件处