食管癌组织hmsh2 mrna的表达和启动子区甲基化.docVIP

食管癌组织hMSH2 mRNA的表达和启动子区甲基化 作者：张功员 刘秋亮 乐晓萍 丁一 张钦宪 【摘要】 　　目的：检测食管癌组织中hMSH2 mRNA的表达和启动子区甲基化异常. 方法：食管癌标本及相应正常食管黏膜组织32例. 原位杂交法检测hMSH2 mRNA的表达，甲基化特异PCR（MSP）法检测错配修复基因hMSH2启动子区甲基化. 结果：食管癌组织中hMSH2 mRNA阳性表达率为46.9%，正常组织为84.4%（Plt;0.05）. hMSH2 mRNA阳性表达率与食管癌患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤位置、病理类型、组织学分级、淋巴结转移、浸润深度等均无关（Pgt;0.05）. 食管癌组织中hMSH2启动子区甲基化发生率为34.4%，正常食管黏膜组织未发现甲基化，2组甲基化阳性率相比较差异有统计学意义（Plt;0.01）；高龄患者（≥70岁）癌组织中hMSH2启动子区甲基化发生率（85.7％）明显高于较低龄患者（lt;70岁）(20.0％)(Plt;0.05)；病理组织学Ⅲ,Ⅳ级食管癌组织中hMSH2启动子区甲基化发生率（70.0%）高于Ⅰ,Ⅱ级（18.2%）（Plt;0.05）. 食管癌组织中hMSH2 mRNA阳性组启动子区甲基化的发生率（13.3%）低于hMSH2 mRNA表达阴性组（53.0%）（Plt;0.05）. 结论：hMSH2的表达缺失是食管癌发生的早期事件；食管癌组织中hMSH2基因启动子区甲基化与患者年龄和肿瘤病理类型可能有关；hMSH2基因的失活与其甲基化有一定关系. 【关键词】 食管肿瘤 hMSH2基因 mRNA 甲基化 0引言 中国是世界上食管癌发病率和死亡率最高的国家，而河南林县及其相邻的辉县、安阳等地是我国也是世界上食管癌发病率和死亡率最高的地区［1］. 我们应用原位杂交方法，检测了食管癌和正常食管组织中错配修复基因hMSH2 mRNA的表达，并结合患者的临床病理资料进行分析；应用甲基化特异PCR（MSP）方法检测食管癌组织中hMSH2基因启动子区的甲基化状态，探讨了其与食管癌发生、发展的关系. 1对象和方法 1.1对象食管癌患者32(男19，女13)例， 年龄50~78 (62.8±7.4)岁. 术前均未接受放化疗. 取其手术切除癌标本及相应正常食管黏膜组织，全部手术切除标本均经2位以上病理学专家诊断证实. 其中鳞癌25例，腺癌5例，腺鳞癌2例；组织学Ⅰ,Ⅱ级22例，Ⅲ,Ⅳ级10例；无淋巴结转移23例，有淋巴结转移9例；食管上段癌4例，中段癌16例，下段癌12例；肿瘤最大直径lt;5 cm 17例，≥5 cm 15例；浸润至黏膜1例，浸润至肌层18例，浸润至全层13例. 32例标本均于切除后0.5 h内，在癌灶及正常残端取约1 cm×1 cm×1 cm大小的组织块2份，一份40 g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋；另一份提取DNA. 1.2方法原位杂交试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司. 所有操作均按说明书进行［2］. 标本采用蛋白酶Ｋ消化，酚／氯仿／异戊醇抽提，乙醇沉淀的经典方法提取ＤＮＡ. 应用CpGenome DNA Modification Kit(Intergen)试剂盒修饰DNA. PCR扩增参照文献［3］设计针对hMSH2启动子去甲基化和甲基化的特异性引物. hMSH2去甲基化引物序列为：5′GGTTGTTGTGGTTGGATGTTGTTT３′（正义），5′CAACTACAACATCTCCTTCAACTACACCA３′（反义），产物长度151 bp；甲基化引物序列为：5′TCGTGGTCGGACGTCGTTC３′（正义）,5′CAACGTCTCCTTCGACTACACCG３′（反义），产物长度150 bp. 反应总体积50 μL ，反应体系为10×PCR buffer(Mg2+ plus) (Takara) 5 μL, 2.5 mmol/L dNTP (TaKaRa) 4 μL， 20 μmol/L引物(Sangon)各1 μL, 修饰后DNA模板2 μL，83.35 mkat/L Taq DNA聚合酶（Takara） 0.5 μL ,循环参数：95℃变性5 min, 95℃ 50 s, 58℃(去甲基化)／56℃（甲基化） 50 s, 72℃ 50 s,循环36次，最后72℃延伸5 min. 原位杂交染色后DAB试剂盒进行最终的反应，镜下观察，以细胞胞质有棕色颗粒出现为阳性表达，胞质无着色为阴性表达. PCR产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳，EB染色，溴乙锭紫外灯下观察结果并记录. 统计学处理:组间比较计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验