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第六章 高效液相色谱法 6.1 概述 6.2 高效液相色谱仪 6.3 高效液相色谱法的类型 §6-1 概述 与经典液相色谱的比较 与气相色谱的比较 ① 气相色谱的流动相是色谱惰性的，不参与分配平衡过程，而液相色谱中流动相参与固定相争夺样品分子，为提高选择性增加了一个因素。 ② 液相色谱固定相类型多,如离子交换色谱和排阻色谱等，作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可能的。 ③ 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利于色谱分离条件的选择。 3、液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易，而且回收是定量的，适合于大量制备。 4、液相色谱缺乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。 为了获得高柱效，高效液相色谱使用粒度很小的固定相（10μm），因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。它是仪器最重要的部件：由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成。 对高压泵的要求：密封性好，压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性。 进 样 系 统 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5-30cm），所以柱外展宽（即柱外效应）较突出。进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。 进样方式：注射器进样、阀进样、自动进样器。 分离系统——色谱柱 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm。 检测系统 HPLC与GC一样，要求检测器灵敏度高，重现性好，定量准确，对温度和流速的变化不敏感，应用范围广，线性范围宽等优点。 选择性检测器：它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光检测器等。 通用型检测器：它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。 荧光检测器(FLD) 示差折光率检测器(RID) 原理: 利用纯流动相与包含样品的流动相之间的折射率不同，检测器把这种差值检测出来，给出信号，信号的大小与样品含量成正比。 特点：通用性强，线性范围宽。主要缺点是灵敏度低，不适宜痕量分析，对温度变化敏感，不能用于梯度淋洗。 6-3 高效液相色谱法的主要类型及分离原理 一、 液-固吸附色谱liquid-solid adsorption chromatography 二、 液-液分配色谱liquid- liquid partition chromatography 化学键合相色谱法 键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基(Si一OH)上。它具有固定相不易流失、柱效高、选择性好及可用于梯度洗脱等特点。 正相键合相色谱：采用极性键合固定相，如硅胶一CN、硅胶一NH2等；流动相是采用非极性或极性小的溶剂（如烃类），或在其中加入适量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等）以分离极性化合物。 反相键合相色谱：采用极性较小的键合固定相，如硅胶一C18H37（简称ODS)、硅胶一苯基等；流动相是采用极性较强的溶剂，如甲醇—水、乙腈一水、水和无机盐的缓冲溶液等。 三、 离子交换色谱法ion-exchange chromatography 四、 排阻色谱法size- exclusion chromatography * High Performance Liquid Chromatography (HPLC) 高效液相色谱法是继气相色谱之后，70年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术。 高效液相色谱是在气相色谱和经典液相色谱的基础上发展起来的。现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。不同点仅仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的效率 和实现了自动化操作。 高压——流动相采用高压输送（最高输送压力可达4.9?107Pa） 高速——分析周期短 高效——每米塔板数可达几万或几十万。 高灵敏度——使用高灵敏度的检测器 1、应用范围不同 气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难。致使其应用受到一定程度的限制，据统计只有大约20%的有机物能用气相色谱分析； 液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制，它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，大约占有机物的70～80%。 2、液相色谱能完成难度较高的分离工作 在实际应用中，这两种色谱技术是互相补充的。 §6–2 高效液相色谱仪 北京瑞利 高效液相色谱仪一般可分为4个主要部分：高压输液系统，进样