13-动物细胞工程-药生所选编.ppt

世界生物医药发展概况 自上世纪90年代以来，生物医药市场增速一直都维持在全球药品市场增速的2-3倍。以2007年为例，全球生物技术药物年销售额同比增长12.5%，总额突破750亿美元，这一增速是2007年全球药品市场增速（6.4%）的两倍。 抗体药物是近年来增长率最快的生物技术药物，全球年销售额从1997年的3.1亿美元上升到2007年的270亿美元，十年内增长了87倍。抗体药物在生物药物产业中所占份额也从2000年的1/5上升到2007年的1/3，且年均增长12.4%，远远高于全球制药行业6%的增长水平。 经济学家们预计2007～2012年的抗体药物年平均销售额增长率将保持在14%左右，实际超过预计。 当前的生物技术研究前沿 蛋白翻译后修饰的原因 蛋白活性调节的需要 蛋白相互作用的需要 亚细胞水平定位的需要等 蛋白质翻译后修饰 主要内容: 泛素化 糖基化 磷酸化 乙酰化 甲基化 泛素化在生命过程中的作用 泛素化是泛素与其他蛋白结合，并进一步降解蛋白的过程。 对于细胞分化、细胞器的合成、细胞凋亡、DNA 修复、新蛋白的合成、调控细胞增殖和蛋白质运输等生理过程都起到很重要的作用。 蛋白糖基化的作用 糖基化在生物过程中起着重要作用，如免疫保护、病毒复制、细胞生长、细胞之间黏附、炎症的产生等。 蛋白磷酸化的作用 可逆的磷酸化过程几乎涉及所有的生理及病理过程，如细胞信号转导、肿瘤的发生、新陈代谢、神经活动、肌肉收缩以及细胞的增殖、发育和分化等作用。 蛋白的乙酰化作用 组蛋白的乙酰化和去乙酰化是基因表达过程中重要的调控方式，是转录过程中的关键修饰。组蛋白去乙酰化酶通过去除组蛋白的乙酰基和其他转录调控参与肿瘤发生和进展。 蛋白甲基化的作用 组蛋白上的甲基化，不仅在真核细胞染色质的遗传外修饰中占有中心地位，对细胞分化、发育、基因表达、基因组稳定性及癌症研究均有深远的影响。其他类型的甲基化的异常或甲基化酶的突变常会导致疾病的发生。 生物反应器 单批细胞培养及反应时间 1、化学法 磷酸钙沉淀法： 目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀的DNA微细颗粒，易通过细胞膜进入细胞内，并整合到受体细胞基因组中，在适当条件下得以表达。方法简单，但转化效率低。 Ca2(PO4)2+DNA → 混合微细颗粒 （Ca离子浓度 125 mmol， DNA 离子浓度 5～0ug/ml， PH 7.0） ↓ 沉淀反应20~30min ↓ 细胞在沉淀物中暴露 5~24h 2、物理方法 电穿孔法（electroporotion） 将细胞置于高压脉冲电场中，通过电压使细胞产生可逆性的穿孔。周围基质中的DNA可渗进细胞，进而表达。 瞬间 细胞 细胞膜核摸通透性增加 高压脉冲 DNA渗入细胞 3、显微注射法（microinjection ）利用显微操作把目的基因直接注入靶细胞或细胞核中 单克隆抗体的应用 1．医学研究 研究工具，如Western blot, Immunoprecipitation, ELISA等； 信号传导分子活性的阻断或促进剂，药物筛选等。 2．纯化蛋白 利用单抗对抗原（目的蛋白）的特异性结合性质，制备蛋白纯化柱。 3．医学诊断 用于疾病的诊断，包括癌症、肝炎病毒、SARS病毒、细菌及血吸虫等数百种疾病的诊断； 4．疾病防治 在疾病治疗方面，包括恶性肿瘤、心血管疾病、自身免疫性疾病、器官移植 、感染性疾病等。 细胞转基因遗传标记的选择系统 1．二氢叶酸还原酶基因选择系统 (dhfr) 2．胸苷激酶基因选择系统 (tk) 3．新霉素磷酸转移酶基因 (neo) 4．氯霉素乙酰转移酶基因 (cat) 5．绿色荧光蛋白基因 (gfp) 特定的遗传标志（基因）和相应的选择培养剂: MTX (dhfr), HAT (tk), 四环素 (tetr), 卡那霉素 (kanr) 和新霉素 (neo) 基因。 细胞株筛选 1．传统筛选方法 最常用的方法是有限稀释克隆（LDC）； 2．流式细胞术和细胞分选 膜标记技术，优势在于筛选数目大幅增加； 3．基于细胞分泌率的高表达细胞的筛选 凝胶微液滴技术检测，基于基质的分泌检测； 4．细胞筛选的自动化系统 激光激活分析和处理系统，自动挑选克隆， Cello系统。 四、杂交瘤技术 杂交瘤与单克隆抗体 单克