试验报告[青枯-2010-0914]第1页，共2页编号农业微生物研究中心.docVIP

编号：生物[2010-11-10], 共10页 承担单位：福建省农科院农业生物资源研究所 试验设计： 试验项目：芽孢杆菌16S rRNA的生物信息学初步分析 试验人员：唐唯其 试验负责： 报告日期：2010-11-10 计数月份：2010年10月 研究资格系数 (0.5-1.0) 实验设计系数 （0.9-1.0） 报告得分 总分 实验设计 实验记载 实验分析 实验简报 实验文章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设计，实施实验，记载，分析清晰，结论清晰文献完整，发表水平 农业微生物研究中心 电话: 0591 传真: 0591 试验目的 通过对芽孢杆菌16S rRNA的比对分析，认识16S rRNA的序列特征，从而设计芽孢杆菌的通用性引物。 实验内容 2.1 从NCBI获得部分芽孢杆菌16S rRNA 通过关键词：16S ribosomal RNA AND Bacillus[ORGN]在NCBI Entrez上进行搜索，可以得到20651项结果（2010年11月，ORGN为限定词，搜索物种名），可知各种芽孢杆菌（Bacillus）提交至NCBI的16S rRNA很多，相比，23S rRNA在NCBI上只有229项搜索结果。 在本实验中，不需要要对所有的16S rRNA进行分析，只需要取出其中有代表性的一部分16S rRNA来进行本次实验。因此首先取一条或数条完整的芽孢杆菌16S rRNA，本次实验选择Brevibacillus brevis NBRC 100599（已完成全基因组测序）的一个16S rRNA，长度为1553bp，然后通过该序列在NCBI基因组的blast数据库（/sutils/genom_table.cgi）中进行BLASTN比对，匹配得到其他芽孢杆菌的16S rRNA，如图1（NCBI BLAST数据库截图）所示选中所有芽孢杆菌选项。 图1. NCBI上芽孢杆菌的BLAST数据库 图2 IMG数据库上显示基因组测序为Finished的芽孢杆菌及其分类 2.2 芽孢杆菌16S rRNA多序列联配 多序列联配的工具采用clustalw，使用命令行参数“-infile=”和“-outfile=”分别指定输入文件和输出文件即可，在没有其他参数指定的情况下，输出格式为clustalw格式（aln格式）。通过Perl编程将aln转换为phy格式（Phylip所要求的输入格式），之所以不采用clustalw的参数“-output=phy”，来输出phy格式，是因为，默认序列名长度仅为10个字符，会导致重名。（perl脚本源代码见附录） 2.3 构建芽孢杆菌16S rRNA的系统发育树 构建系统进化树常用的软件有phylip、phyML和MEGA等，在本实验中，phylip采用邻接法构建系统发育树，phyML采用最大似然法构建系统发育树，最后用MEGA显示进化树。 构建进化树软件包phylip，首先使用seqboot程序，读入多序列联配的phy文件，生成一个用于bootstrap检验的新的phy文件，再使用neighbor程序进行邻接法的系统发育树构建，最后用consense生成检验后的一致性进化树。 使用PhyML的命令行模式，设定命令行参数如下：“-i 输入phy文件”和“-d nt”表示数据类型为核酸序列。 将phylip和phyml计算得到的tree文件的后缀改为“tre”，就可以用MEGA打开，显示进化树。 试验结果 3.1 芽孢杆菌16S rRNA 根据一个已知的16S rRNA序列与NCBI的细菌基因组进行BLASTN，并从blastn的结果中提取各个菌株（已完成全基因组测序的芽孢杆菌）的16S rRNA，各自取一条序列进行多序列联配，并构建系统发育树。 在表1中，列出了当前已经完成全基因组测序的35种芽孢杆菌的rRNA数量及其refseq号。rRNA数量最小为5个，最多有15个，同一属（family）的菌株rRNA数量基本是一致的。 表1. 35种芽孢杆菌的rRNA数量 基因组的refseq Acc 芽孢杆菌 菌株Strain rRNA数量 NC_014551 Bacillus_amyloliquefaciens_DSM7 10 NC_009725 Bacillus_amyloliquefaciens_FZB42 10 NC_012659 Bacillus_anthracis_A0248 11 NC_003997 Bacillus_anthracis_Ames 11 NC_012581 Bacillus_anthracis_