第3章 细胞融合与单克隆抗体-1幻灯片.ppt

融合的可能机制 ？脱水作用能使细胞凝聚，并使膜结构发生 变化 ？改变膜表面电荷或膜电位，而导致膜上蛋 白质颗粒聚集及膜脂分子随之发生重排之 故。 ？ 3.1 细胞融合(cell fusion) 初步分析 可能是由于带有大量负电荷的PEG分子和原生质体表面的负电荷间，在钙离子的连接下形成静电键，促使异源的原生质体间的粘着和结合，在高pH、高钙离子溶液的作用下，将钙离子和与质膜结合的PEG分子洗脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使两种原生质体上的正负电荷连接起来，进而形成具有共同质膜的融合体。 3.1 细胞融合(cell fusion) PEG诱导过程注意事项： 控制与分子量、浓度和处理时间 悬浮法：将细胞悬于40～50％的PEG4000进行 溶，处理1～2分钟为宜。 离心法：先将细胞混合物悬于30～40％的 PEG4000，再离心进行融合，则可适 当延长融合时间，以5～8分钟为宜。 3.1 细胞融合(cell fusion) PEG诱导注意事项： pH值以pH7.4～8.0为宜，或略偏碱性pH8.0～8.2。 辅以5～15％的DMSO或在融合前用PHA处理一下，效 果更好。 3.1 细胞融合(cell fusion) PEG融合法优点 效率高 材料方便，操作简易 效果稳定 PEG融合法缺点 对细胞有毒性 3.1 细胞融合(cell fusion) 3.1 细胞融合(cell fusion) 物理电融合诱导 机制 在直流电脉冲的诱导下, 原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位变化, 使原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂,进而质膜开始连接,直到闭合成完整的细胞融合体 3.1 细胞融合(cell fusion) 电融合诱导法原理示意图 3.1 细胞融合(cell fusion) 电融合优点： 融合效率高，可达50～80％ 产生杂交细胞的频率高，是PEG法的100倍。 操作简便、稳定，但需设备。 对细胞无毒害作用。 可在显微镜下观察操作。 3.1 细胞融合(cell fusion) 融合率 融合细胞的细胞核总数 视野内全部细胞的细胞核总数 ×100％ 融合率= 3.1 细胞融合(cell fusion) 植物细胞融合基本过程 去除细胞壁以获得大量的原生质体 诱导细胞融合形成杂种细胞 细胞相互靠近 形成细胞桥 – 最关键的一步 胞质渗透 细胞核融合 筛选,培养,促进细胞分裂,分化, 从细胞团,愈伤组织到最后成株 3.1 细胞融合(cell fusion) 动物细胞融合基本过程 动物单个细胞的获得 组织的获得 组织的消化 诱导细胞融合形成杂种细胞 筛选，培养 3.1 细胞融合(cell fusion) 3.1 细胞融合(cell fusion) 植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较 比较项目 植物体细胞杂交 动物细胞融合 细胞融合的原理 细胞膜的流动性、植物细胞全能性 细胞膜的流动性 细胞融合的方法 去处细胞壁后诱导原生质体融合 使细胞分散后诱导细胞融合 诱导方法 物理（显微操作、电融合） 化学（聚乙二醇） 物理、化学方法（同左） 灭活的病毒 用途 获得杂种植株 制备单克隆抗体 3.1 细胞融合(cell fusion) 影响细胞融合的因素 (1) 亲本细胞表面性质，表面覆盖绒毛而不规则者较易融 合；表面光滑者较难融合。 (2) 细胞种类不同，融合效果不同，如腹水癌及株化细胞较易 融合，而淋巴细胞或血球细胞几乎不融合。 (3) 细胞融合时需要适宜温度和运动状态。如仙台病毒诱导欧 利希氏腹水癌细胞融合时，于37 ℃振摇时易于融合，且 融合效率与病毒量呈正比。但在34 ℃振摇则融合率下降。 在37℃时不振摇则几乎不融合。 影响细胞融合的因素 3.1 细胞融合(cell fusion) (4)细胞融合过程中，通常耗氧量较大．缺氧时经常不融合。空气中含氧量大于20％时有一定融合率，但有些细胞在无氧条件下也可融合。 (5)有些细胞融合时需要Ca2+，否则不融合，细胞蛋白质亦发生 变化。实验表明Sr2+、Ba2+、Mg2+、Mn2+等离子可代替 Ca2+．但有效浓度较Ca2+大的多。融合时最适合的离子强度 一般为0.1mol/L (6)最适合的pH为7．4—7．8之间，在此范围之外，融合率均较 低。 3.1 细胞融合(cell fusion) 融合细胞的特征及其意义 染色体组不稳定，尤其种间杂交细胞,培养过程中染色体会逐渐丢失