SARS-CoV结构蛋白的抗原性鉴定、DNA免疫与RNA干扰的.docVIP

第二军医大学 博士学位论文 SARS-CoV结构蛋白的抗原性鉴定、DNA免疫与RNA干扰的研究 姓名：赵平 申请学位级别：博士 专业：微生物学 指导教师：戚中田  英文缩略词表 ?????? 英文缩写 英文全 ? 称 ?氨基酸中文名称 抗体 ? ? 抗原 ? 碱基时 ? ???? ??? 牛血清白蛋白 ?????? ???? ??? ?? ?? ??细胞培养液 脱氧核糖核酸 ?? ???????? 脱氧三磷酸核苷 二硫代苏糖醇 增强的绿色荧光蛋白 酶联免疫吸附实验 胎牛血清 ?????? ??????? ?? ???? ???．??? ??? ? ?? 小时 ? 乙型肝炎病毒 丙型肝炎病毒 人类免疫缺陷病毒 ? ???????? 辣根过氧化物酶 干扰素? ????? ?????? ? ??????? 千骟基 ? ????? 千道尔顿 ?培养基 分钟 ? ?籥???? ??? ??? 核苷酸 ? ????? 开放阅读框架 聚丙烯酰胺凝胶 磷酸盐缓冲液 聚合酶链式反应 苯甲磺酰氟 ?? ?? ??????? ??? ???? ????? ?? ???? ?????????? ?????? 核糖核酸酶 核糖核酸 ?? ????逆转录聚合酶链式反应 秒 ?????????—????? ??? ? ?? ??? 严重急性呼吸综合征 ??冠状病毒 十二烷基磺酸钠 ???? ??．????? ??? ???? ???? ??? 四甲基联苯胺  第二军医大学博士学位论文 摘 要 ??????，随后也被 ???? 称为严重急性呼吸综合征?? ??? ?卤患?ㄎR恢中碌墓谧床《荆?琶??猄??谧床《???．??。冠状病毒是一类 球形、有包膜的病毒，基因组为长约? 肠道疾病。??．??幕?蜃榻峁刮#??帽状结构一复制酶????掏惶堑鞍??．小包膜 蛋白???ぬ堑鞍??．核衣壳蛋白??畃??尾．??１狙芯坑么蟪Ω司?淼?隽薙??瓹? 的结构蛋白及??”蛋白，检测了??恢复期患者血清中的抗体情况，构建了?隢蛋 扰?????。该系列研究对于了解??—??拿庖哐?氐慵拔7⒄筍??瓹?感染 的防治方法有一定参考意义。 扩增??．??慕峁沟鞍譻、??、?鞍谆?蛴氲鞍酌??Ⅳ??颉Ｆ渲蠸基因 ?????????????????? ??～?? 别将这些基因片段插入原核表达质粒栽体????、???、???与??一??， 转化到合适的大肠杆菌，用??或加热培养基的方法诱导目的基因的表达。菌体样品进行 ??甈??治觯?婧笥昧椒菘筍??瓹? ??分析．结果表明，??、??、??、??、????及??”表达质 的反应最强，?鞍状沃??於蜸蛋白中，??的反应最强，??与??的反应强度相似， 原决定簇位于该蛋白的氨基末端。 用???树脂分别纯化大肠杆菌表达的??、??与?鞍祝??幻噶0澹?訣?? 清抗?? ??粜浴＝峁??徊奖砻鳎琋、?鞍锥杂赟??瓹? 白抗体在??恢复中的作用值得进一步研究。 二、??蛋白基因疫苗在小鼠的免疫试验 为载体检测合成的序列与相应的野生序列的表达效率，结果表明密码子优化可明显提高该基 ?的???魏蚐基因??～??  基因。再利用??虻???的风，?盖形坏悖?ê铣傻膕基因??? 分别以大肠杆菌重组??、??及??—??ú《究乖?觳庑∈笱G逯械目筍??瓹? ??固濉＝峁?砻鳎琒基因??呙缒茉谛∈笥行в盏伎筍??瓹? 将??虿迦胝婧吮泶镏柿Ｔ靥錺?．???玫街刈楸泶镏柿???，转染??细胞， 细胞裂解液进行??????治觯?砻鞲弥柿Ｄ鼙泶颪蛋白．将质粒??甆肌肉注射接种 ??／?∈螅?觳庑∈笱G逯械腘蛋白??固澹?弥刈镹蛋白体外刺激小鼠脾细胞，捡 异性抗体与?馨拖赴?庖哂Υ穑?⑾赴?置诘南赴?蜃蛹翱固逖抢嗟姆治龌贡砻鳎琋蛋白 免疫应答对于抗??．??粗萍按俳鳶等包膜蛋白的抗体反应可能均起重要作用，因此， 三、抗??．??「扇臨?的筛选务功能鉴定 ?????? 成的???泶锟蚣苡隢及???融合基因表达质粒共转染??细胞，观察细胞内绿 ????的候选???月躺?ü庥薪锨康囊种谱饔茫?ǜ胹?? 中的两个核苷酸位置反向颠换则使之完全丧失干扰活性．构建该???碚庠蕴澹?隢．?? 的表达。将该表达载体与?．??以质量比??共注射小鼠胫骨前肌，结果发现在注射后 的???欤?∈蠊趋兰∽橹?诘挠ü饩?幻飨砸种啤＝峁?砻鳎瑂??在细胞和活体模型 内均可高效、特异性抑制??虻谋泶铮?杂赟??瓹?感染的治疗具有潜在应用前景。 四、小结 ?⒈狙芯坑么蟪Ω司?泶锍隽薙??瓹?的结构蛋白并用??恢复期血清对其进行 抗原性分析，结果表明?鞍拙哂星靠乖?裕?鴖、?鞍状沃?瑂蛋白的抗原决定蔟可能 进一步研究． 可诱导体液免疫应答，其中?鞍谆箍捎