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临床荧光PR结果分析及常见问题
临床荧光PCR结果分析及常见问题
中国人民解放军三零二医院 王海滨
一、荧光 PCR 技术在临床诊、疗中的应用
PCR 技术是于 1983 年由 Mullis 发明,后来传到我国,但是由于实验污染的问题, 1998 年卫生部取缔 PCR 实验方法在临床诊断中的应用。荧光 PCR 出现后,污染减少很多,但近几年由于磁珠的应用,污染又再起。 2003 年, PCR 在 SARS 的早期诊断中非常有效,当时使用的是电泳法。 H1N1 甲型流感( 2009 ):荧光 PCR 技术作为确诊指标( 755 份 / 天)。疾病易感基因的研究( SNP ): CR1/ 丙型肝炎 IL-28B 。疾病(肿瘤)易感基因的鉴定。
二、影响临床荧光 PCR 检测结果的因素
(一)影响临床荧光 PCR 检测结果的常见因素
1. 检验因素:
实验室硬件、仪器、试剂、人员素质、技术水平、管理水平。
2. 非检验因素:
标本采集、质量、部位、标本保存、条件、时间、标本中的干扰物质、样本丢失!
(二) 加强检测前标本的质量管理——避免问题重复发生
规范标本前处理流程、制度化的重要性,建立不合格标本记录和定期总结制度、制定解决措施与可行路径(编号和项目错误等),查找标本丢失可能的环节。加强本室新进工作人员流程培训,经常性进行临床医护的交流与培训。
(三) 实验室分区
分为:试剂配制、核酸提取、 PCR 扩增以及开放产物分析等区域。
分区目的:通过物理分割达到标本、试剂或使用器具等被沾染或掺入污染,标本间的交叉污染等。
分区要求:至少要有清洁的试剂配制和核酸制备区
三、试剂配制
(一)试剂配制室的设置与维护
以空间内无核酸气溶胶为准!
1 .正压、清洁进风 ( 壁挂式空调 ) 。
试剂冰箱内勿存放病原或核酸相关物品!定期清洁除霜!
2 .有效氯消毒液清洁实验室台面、地面。
3 .移液器:使用前的清洁。
4 .离心机等:每周定期木浆纸巾擦拭,方法。“一次性物品的使用 - 从 COBAS 的“浪费”中找到均衡!
(二)试剂配制注意事项
试剂配制实际是简单的问题,但是也是非常复杂的环节。
1. 何时配制?如何配制!
在核酸制备好后再进行试剂配制,注意反复冻溶对试剂质量的影响,以及久配不用试剂对检测的影响 ( 如 hot-TaqE) 。
2. 如何避免荧光淬灭?
避免在强光下配制,采用有效氯消毒液后应进行通风或清水擦拭,勿在紫外灯下配制。
3. 交叉污染的避免
试剂与核酸何者先加更合理?
试剂分配中的问题:过吸、残滴(第一孔)。
热盖不能完全阻止蒸发,石蜡油,盖、膜、离心。
(三)试剂配制环境对检测的影响
PPT8 显示的是试剂配制环境对检测的影响,左边的图,是实验室在装修的时候用了一些油漆,在那个环境里面配制的试剂。右边的图,是在无油漆环境下配制的。可以看到左边的图结果很差。
(四)核酸制备
冻存标本使用前要混匀离心后使用;不同类型标本:血清、血浆、细胞、组织、乳汁、痰液、尿液等;标本核酸提取前后的保存;提取后核酸的保存(稳定性);核酸提取标本加入量与核酸得率的关系! 1+1 与 2 的关系;指示剂的引入,可以降低差错率。
PPT10 显示的是指示剂在一管法的应用,可以看到上面蓝色的是核酸提取液,非常清楚,降低了差错。
四、 荧光 PCR 扩增
(一)实验室怎么建?
独立区域、负压通风、物品专用:
1. 实验室清洁用品的专用的重要性。
2. 扩增产物的处理( PCR 管加盖、封膜、石蜡油),用两层封口袋包装后焚烧(如 PPT12 图)。产物的处理必须由专业工作人员或经过培训的工作人员处理。禁止未经培训的研究生、实习生和进修生进入区域对扩增产物进行操作。
3. 仪器清洁处理程序:载板区先用 70% 乙醇清洁。该区所有垃圾需封闭运输并销毁。
4. 地面和空气处理原则。
(二) 荧光 PCR 仪器如何选择?
PCR 实验室的仪器非常多有几十种,应按照实验的要求不同来进行选择。
(三)荧光 PCR 仪器如何维护?
荧光 PCR 仪器的功能模块分为三个:
1. 温度模块
包含最基本的升降温。要保证温度模块的均一性,既不能有边缘效应,也不能有局部温度的影响。
2. 光学模块
即测光系统, PCR 反应的过程中每一个循环都要测一次光,测光不论是照相还是扫描,都有一定的差别,光学模块的敏感性要高。
3. 软件模块
荧光信号采集以后,要用软件模块来进行分析。分析不但要人性化,而且还要准确,不能有故障。
(四)荧光 PCR 扩增循环数量的选择( 60:50:40cycles )
COBASTAQMAN 用的是 60 个循环,早期是 40 个循环,近几年的荧光 PCR 试剂,循
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