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2011级硕士免疫学实验课 闫东梅 yxn345@ 补体依赖细胞毒试验 实 验 原 理 细胞性抗原与特异性抗体(IgG1,2,3或IgM)的结合可激活补体活化的经典途径，引起细胞膜损伤，膜通透性改变而吸收染料，使细胞着色，胀大而死亡，失去正常的折光性。根据死细胞的多少判断细胞毒性的强弱。 本次实验采用抗Thy-1血清(Thy-1是T细胞的一种表面标志)与小鼠的胸腺和脾的T细胞相互作用，通过激活补体对胸腺和脾的T细胞进行杀伤。 T Cell 细胞溶解现象 补体 T细胞+抗Thy-1抗体 + MAC 实 验 原 理 示 意 图 实验分组 四人一组，1只小鼠/组。 两人做脾，两人做胸腺。 物品分配 器材名称 量/组 试剂名称 量/组 加样器 1把 PBS 10ml 吸头 12个 抗Thy-1血清 0.3ml 载玻片/盖玻片 4套 台酚兰 1瓶 显微镜 1台 补体 0.5ml 小试管 6支 小鼠 1只 滴管 2支 平皿 1对 刻度吸管(5ml) 1支 剪刀、镊子 (直,弯) 1套 纱布块 2块 操作步骤 将3ml PBS加入平皿中。 小鼠脱颈处死，取脾和胸腺(分别位于左侧腹部和胸骨柄处) 取胸腺和脾脏分别放到平皿中，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将其捣碎，再将3-4层纱布覆盖到组织上，然后用滴管隔着纱布将细胞悬液吸出。 按下图加样： 混匀后放置37℃水浴，孵育40分钟。 取出后每管加入50ul台酚兰染液，混匀后立即取出染色的细胞悬液20ul滴到玻片上，用盖玻片盖上，在显微镜下观察。 观察结果：计数200个细胞中死细胞数(死细胞形态为肿胀变大，失去折光性，呈兰色)。 结果判定 ： 加 样 方 法 试管 阳性管(ml) 阴性管(ml) 靶细胞 100 100 抗Thy-1血清 100 — PBS — 100 补体 100 100 阳性管 阳性管 阴性管 Ag+Ab+C Ag+C 细胞毒百分率(%)= 阳性管活细胞数 阴性管活细胞数 )×100% (1- 结 果 判 定 注意事项 靶细胞浓度要适中，过高或过低均会影响试验结果。 台酚兰染色时间不要太长，因为台酚兰本身具有一定的毒性作用，可致细胞死亡。 补体要新鲜采集，三只以上的豚鼠的血清混合。 补体依赖性细胞毒实验的应用 细胞性抗原的测定 单克隆抗体的筛选和鉴定 组织相容性抗原的检查与分型 小鼠胸腺和脾脏中的百分率 应用： 1. 对细胞生抗原的鉴定 2. 细胞性抗原的特异性抗体的鉴定 3.胸腺和脾脏中的T细胞所占的百分数 Page * 小鼠胸腺和脾脏中的百分率 应用： 1. 对细胞生抗原的鉴定 2. 细胞性抗原的特异性抗体的鉴定 3.胸腺和脾脏中的T细胞所占的百分数