考马斯亮蓝法(Bradford法)测定蛋白质含量.课题.ppt

考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在465nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比。 蛋白质与考马斯亮蓝G250的结合十分迅速，约2min即可反应完全，其复合物在1h内保持稳定。 考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。 【器材与试剂】 （一）器材 1. 可见光分光光度计 2. 刻度移液管 3. 移液枪 （二）试剂 1. NaCl （0.15mol/L） 2. 考马斯亮蓝试剂 3. 蛋白质标准液 （1mg /mL） 4. 待测蛋白质溶液 1.如黑板上表格操作 2.绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。 3.算出待测蛋白质浓度？ 分光光度计的分类 分光光度计的基本结构 无论哪一类分光光度计都包括：光源、单色器、吸收池、检测器和测量仪表。分光光度计各部件的次序如图所示: 思考题 1.蛋白质的测定方法有几种？比较各种方法的优缺点。 2.在考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度时，当蛋白质浓度偏高时，为什么曲线会适当下斜? * * 考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质含量 【实验目的】 1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质的原理与方法。 2. 熟练分光光度计的使用和操作方法。 【实验原理】 考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。 考马斯亮蓝G250在酸性溶液中呈棕红色，最大吸收峰在465nm；当它与蛋白质通过范德华键结合成复合物时变为蓝色，其最大吸收峰移至595nm，而且消光系数更大。 在一定蛋白质浓度范围内 (1～1000μg/ml）,蛋白质－染料复合物在595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。 由于蛋白质－染料复合物具有很高的消光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度（最低检出量为1μg）。 试管编号 0 1 2 3 4 5 6待测 标准蛋白溶液（mL） 0 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.10 0.15mol/L NaCl（mL） 0.10 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04 0 考马斯亮蓝试剂（mL） 5 5 5 5 5 5 5 摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色 A595nm 0 ？ ？ ？ ？ ？ ？ 【分光光度法的基本原理和分光光度计的 使用方法】 定义: 分光光度法是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的分析检测技术。 特点: 灵敏、精确、快速和简便，在复杂组分系统中，不需要分离，即能检测出其中所含的极少量物质。 应用: 生物化学研究中广泛使用的方法之一，广泛用于糖，蛋白质，核酸，酶等的快速定量检测。 红外分光光度计: 可见光分光光度计: 紫外分光光度计: 测定波长范围为 大于760 nm的 红外光区 测定波长范围为 400~ 760 nm的 可见光区 测定波长范围为 200～400 nm的 紫外光区 可见光谱 可见光范围内波长和颜色的关系 入射光强度 Io 透射光强度 I 样品池 检测器及仪表 单色器 光源 光照射到物质上，物质的分子结构决定哪些特定波长的光被吸收。这一现象符合符合朗伯－比耳定律。 入射光强度 Io 样品浓度c 光程 b 透射光强度 I 当一束平行单色光(I0)照射有色溶液时，光的一部分被吸收，一部分透过溶液(I) 朗伯—比尔定律: A=lg(1/T)=Kbc A为吸光度; T为透光度,是透射光强度比上入射光强度（I/I0); c为吸光物质的浓度; b为吸收层厚度(光程）.  物理意义 当一束平行单色光垂直通过某一吸光物质时,其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度b成正比.  * * *