细胞培养基本技术研究报告.ppt

第三章 细胞培养基本技术 内容： 原代细胞分离、培养（酶消化法和组织块培养法）。 细胞生长状况的观察。 培养细胞一代生长过程。 传代。 冻存与复苏。 细胞培养注意事项（如细胞污染）。 细胞培养的一些专业术语介绍（如细胞株、系，上皮细胞型、成纤维细胞型） 第一节 细胞原代培养 原代培养也叫初代培养，是从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。 原代培养组织或细胞的特点： 1．组织和细胞刚刚离体，生物学特性未发生很大变化，仍具有二倍体遗传性，最接近和反映体内生长特性，是药物测试、细胞分化等实验的很好对象； 2. 缺点是成分组成比较复杂，因而原代培养细胞部分生物学特征尚不稳定，如要做较为严格的对比性实验研究，还需对细胞进行短期传代后进行。 一、原代培养的方法 (一)、消化培养法 (二) 、组织块培养法 （三）、其它（如机械方法） (一)、消化培养法 1、培养前的准备 ------培养用品的消毒 根据所要进行的具体培养对象如组织块贴壁原代培养、末梢血白细胞培养、传代培养等，准备培养所需器械和物品，清点无误后进行清洗、包装和消毒灭菌。 ------培养室的消毒 培养室每天用0.2%的新洁尔灭或2%~5%的来苏儿拖洗地面一次（拖布专用），30瓦紫外灯管照射消毒30~50分钟。 -------超净工作台的消毒 2、无菌培养操作注意事项： （为保证无菌，除实验所需物品需预先消毒外，实验中还需保持无菌操作）。 -----工作台面上的用品要布局合理，原则上是右手使用的东西置右侧，左手使用的东西置左侧，酒精灯置中央； -----实验前点燃酒精灯，一切操作如安装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都应在火焰近处并经过烧灼进行。 3、常用消化试剂： 胰蛋白酶、胶原酶、蛋白水解酶、EDTA 4、原代细胞培养程序 1、取材 2、漂洗 3、剪切 4、消化 5、过滤 6、清洗 7、计数 8、接种 （1）、培养细胞的取材 1. 取材的组织最好尽快培养，若不能及时培养，可将组织浸泡于培养液内放置于冰浴或40C冰箱。若组织块很大，应先将其切成1cm2以下的小块再低温保存，但时间不能超过24小时，因放置时间长或组织块太大都易造成细胞的死亡； 2. 取材时严格无菌操作。用预先消毒好的器皿和带有少量培养液的培养瓶进行取材。所取组织要尽量避免紫外线照射或接触任何化学试剂及有害药物如碘、汞等。从消化道及周围有坏死组织等有污染因素存在的区域取材时，为减少污染，可用含500~1000单位/ml的青、链霉素BSS液漂洗5~10分钟，或用10% 达克宁注射液冲洗浸泡10分钟再作培养； 3. 取材时要细心去除组织中的血液、结缔组织、脂肪及坏死组织等。修剪和切碎过程中，为避免组织干燥，可将其浸泡于少量培养液中； 原代细胞培养操作（鼠胎组织细胞培养为例） 取材：用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。把整个孕鼠浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀在躯干中部环行剪开皮肤，剖腹取出子宫置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀剪开子宫，取出鼠胎，剪去头、爪，以平衡盐溶液洗去血污 切割：用平衡盐溶液将取出的组织块清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清 消化、接种培养：加入0.25％胰蛋白酶消化液（5-10倍量），与组织块混匀。置37℃水浴，观察消化情况（每隔几分钟摇动一下试管），静止，吸去上清，加入5～10ml细胞培养液，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养 （2）例如：滋养层细胞分离与培养： （A）真空负压抽吸的早期绒毛组织在无菌条件下置于冰浴PBS（含1 mM葡萄糖）中取回。 （B）在无菌条件下立即用无Ca2+和Mg2+的PBS漂洗15-20次以除去血块。 （C）用解剖刀片从基膜上轻轻刮下绒毛，用剪刀剪碎至1-2毫米左右。 （D）加入5 ％胰蛋白酶330μl(1：25)至10ml细胞悬液中，4℃消化45min。勿动，静置，然后去上清。 （E）重新加入消化液37℃消化10min。勿动，静置，然后去一半上清。加等体积Ham’s F12:DMEM 1:1(FD)培养液（内含10 ％胎牛血清、1 mM丙酮酸钠和2 mM谷氨酰胺）终止消化，吹打细胞悬液。 （F）再加入终浓度为15 IU/ml的DNA酶Ⅰ37℃消化10 min。吹打细胞呈悬浮状，经80目和150目细胞筛过滤，1,000×rpm离心10 min收集细胞。 （G）重复离心洗涤二次，再次重悬细胞，细胞悬液经1.25-2.5％BSA（FD配制）的密度梯度沉降1 h。 （H）收集淡黄色的细胞滋养层细胞，清洗一次，接种于涂有I型胶原的24孔