2012CB966500非整合人诱导性多能干细胞(iPS)及相关技术用于β地中海贫血治疗的研究.docVIP

项目名称： 非整合人诱导性多能干细胞（iPS）及相关技术用于β地中海贫血治疗的研究 潘光锦 中国科学院广州生物医药与健康研究院 2012.1至2016.8 中国科学院   二、预期目标 总体目标： 由于遗传导致的β-地中海贫血是严重危害广东等地区的地方性疾病，目前尚无根治手段。本项目的总体目标是探讨利用病人来源的无DNA整合污染的iPS，通过基因修复联合血液分化的技术途径，探讨建立一套从β-地中海贫血患者的iPS诱导到突变基因原位修复，再到修复后造血干细胞分化的完整技术，为β-地中海贫血患者的移植治疗提供大量自体来源的造血干细胞奠定基础。同时也明确iPS实际应用的可行性及安全性等指标，本项目的完成不仅能够明确iPS及相关技术用于β-地中海贫血治疗的可行性，也为其他一些遗传病的治疗起到重要的借鉴作用。 五年预期目标： 1、建立包含有不同突变类型的地贫病人特异性的无外源DNA整合的iPS库及ES细胞库。约含各突变类型β地中海贫血iPS细胞株50～100株。同时利用废弃的体外受精的胚胎建立10～20株地贫病人的ES细胞株及5株正常人的ES细胞株用于对比研究。 2、建立非整合β地中海贫血病人iPS细胞与地贫胚胎干细胞的基因组稳定性，表观遗传和基因表达的数据库。明确iPS在组蛋白修饰，DNA甲基化等表观遗传方面的稳定性。 3、建立实用性的地贫突变基因修复的技术平台。明确经基因修复后的iPS在基因组，表观遗传等方面的稳定性及干性维持等特性。 4、建立高效诱导iPS细胞分化为造血干细胞的培养条件及对分化的造血干细胞造血重建及移植功能的鉴定动物模型和相关技术； 5、优化造血干细胞体外扩增的培养体系，筛选和鉴定可以用于对干细胞功能和安全性进行评价的分子标记物和指标； 6、通过对比研究iPS诱导分化和脐带血来源的造血干细胞在基因表达及表观遗传特征上的差异，揭示针对造血干细胞增殖，分化及自我更新等生物学特性的新的调控机制。 7、优化非整合病人特异性iPS技术，将目前诱导效率提高100倍左右，诱导时间缩短到2周左右。建立非整合小鼠ESC样的人iPS细胞技术。明确新型人iPS细胞的多能性，基因组稳定性，安全性等指标。 8、 培养研究生30名，建立一支具有国际竞争力的，由优秀中青年科学家组成的创新团队，培养一批能独立从事高水平科学研究的后备力量； 9、在本领域的国际代表性学术SCI刊物上发表20余篇学术论文，其中影响因子高于5的不少于10篇，培养博士生15名，博士后5名。 10、举办一次相关的国际性学术研讨会。  三、研究方案 技术路线： 研究方案： 1、探讨优化建立快速高效的获得iPS的技术 1）在mRNA诱导iPSC的基础上，通过筛选小分子化合物及蛋白，加速非病毒非整合iPSC的诱导；这一套系统我们已经在进行尝试。接下来筛选促进重编程的microRNA，建立传统的iPSC（EpiSC-Lik-iPSC）。 2）利用Dox-inducible的载体（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc）诱导体细胞获得ESC-Lik-iPSC；筛选能够维持自我更新的小分子，我们已经开始相关实验；在此基础上，尝试建立非病毒非整合的ESC-Lik-iPSC。 可行性分析 该部分研究内容的主要承担者赵小阳博士所在的实验室在以往的研究中，开展了大量的诱导iPSC的研究工作，利用病毒为载体高效诱导获得iPSC；并对iPSC在分子水平上进行了充分的鉴定，以及完备的多能性检测。本实验需要开展的工作中， mRNA的体外合成与纯化、microRNA的筛选工作我们已经开展，进展良好。在我们之前的研究中，成功筛选出小分子化合物并改进了iPSC的诱导环境。对于本课题的各个环节，我们进行了细致的研究探讨，认为我们基本掌握相关技术，因此，我们有信心成功完成预期目标。 创新性分析 目前，国内外有多个实验室开展新的不依赖多能性因子的纯药物诱导方式，试图提高iPSC的诱导效率；本课题的特色在于，从提高iPSC的诱导速度出发，筛选新的小分子化合物及蛋白等各种因子，建立一个快速高效且简单易于操作的iPSC诱导系统，降低iPSC表观遗传突变及基因组不稳定的风险，力争应用于将来的临床实验中； 新型的iPSC不仅在理论上有大的突破，还将为iPSC未来的临床应用提供基础，这种iPSC将在大规模培养、基因修复、分化上拥有巨大的优势。与国内外其他实验室相比，本研究更注重与实际应用联系起来，以推动iPSC最终应用于临床治疗。 2、建立非整合β-地中海贫血的病人特异性iPS库。 本部分内容拟在该部分研究内容的主要承担者潘光锦博士以前的实验室建立起来的episome的方法的基础上进行一定程度的修改用来获得地贫病人的iPS。该技术将诱导因子