- 1、本文档共5页,可阅读全部内容。
- 2、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
查看更多
Trizol法提取总RNA
Trizol法提取总RNA
原理:Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。在样品裂解或匀浆过程中,Trizol能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心,样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的水样层后,RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后,样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的形式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA,在有机层中加入异丙醇能析出有机层的蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。
Trizol试剂可用于小量样品(50~100mg组织,5×106细胞),也可用于大量样品(≥1g组织或≥107细胞),对人、动物、植物和细菌、血液提取都适用,可同时处理大量不同样品。一个小时内即可完成反应,提取的总RNA没有DNA和蛋白质污染,可用于Northern blot、RT-PCR、Dot blot、RNase保护分析等。
本试剂为红颜色,便于区分水相和有机相,同时最大限度的保持RNA的完整性。
保存条件:2~8℃避光保存12个月。
实验前需要准备的试剂:
Trizol,氯仿,异丙醇,75%乙醇(用RNase-Free水配制),RNase-Free水。
实验前需要准备的物品:
1ml注射器,1.5ml EP管(DEPC处理过),大、中、小号枪头(DEPC处理)
样品前处理注意点:
选择新鲜血液,不得超过4小时。
选择新鲜组织,生长旺盛的组织。
选择新鲜的幼嫩组织。
选择处于生长旺盛的时期收集细胞。
RNA纯化要求:
纯化后不应存在对酶(如逆转录酶)有抑制作用的物质。
排除有机溶剂和金属离子的污染。
蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降到最低程度。
4.排除DNA分子的污染。
RNA提取的注意事项:
杜绝外源酶的污染。
严格戴好口罩,手套。
实验所涉及的离心管,Tip头,移液器杆,电泳槽,实验台面等要彻底处理。
实验所涉及的试剂/溶液,尤其是水,必须确保RNase-Free。
阻止内源酶的活性。
选择合适的匀浆方法。
选择合适的裂解液。
控制好样品的起始量。
明确自己的提取目的。
任何裂解液系统在接近样品最大起始量时,提取成功率急剧下降。
RNA提取成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功,而不是得率。
Rnase污染的10大来源
手指头
枪头
水/缓冲液
实验台面
内源Rnase
RNA样品
质粒提取
RNA保存
阳离子(Ca,Mg)
后续实验所用的酶
流程:
样品处理:
培养细胞:收获细胞1~5×107,加入1ml Trizol(异硫氰酸胍/酚)(在冰箱旁边取出白细胞即刻加入Trizol),混匀;用1ml注射器反复抽取(约30次)以破裂细胞及剪切DNA,室温静置5min(使核酸蛋白复合物完全分离)。
组织:取50~100mg组织(新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可)置1.5ml EP管中,加入1ml Trizol充分匀浆,室温静置5min。
2.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
3.加入0.2ml氯仿,剧烈振荡15~30s,静置2~3min。
4.4℃离心,12000g×15min。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
5.小心吸取上清至一新的DEPC处理过的1.5ml EP管中(如要分离DNA和蛋白质可保留有机相),加入0.5ml异丙醇,将管中液体轻轻混匀,室温静置10min。
6.4℃离心,12000g×10min。离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。
7.弃上清,于沉淀中加入75%乙醇(冰冷)1ml,振摇,充分洗涤沉淀。
8.4℃离心,12000g×5min。
9.弃上清,短暂离心,小心吸取弃去上清。
10.加入适量(20μl)DEPC (Rnase Free)H20溶解RNA(65℃促溶10~15min)。
11.取2μl进行电泳,其余-80℃保存。
您可能关注的文档
- STC12C5A60S2AD功能的使用.doc
- ST-VP-E014-2014 GCB4B型四泵灌装机验证方案.doc
- STC控制的料车行走系统设计.doc
- STM-N光接口参数.doc
- STM32之DMA彻底研究.doc
- STM32中断入门最简单资料.doc
- stm32f107usbh主模式库解析.doc
- stroop效应实验报告.doc
- summon指令教程.doc
- SQL作业 活期储蓄管理系统数据库.doc
- 2024年新人教版七年级上册语文教学课件 第4单元 13《纪念白求恩》课时1.pptx
- 2024年新湘教版七年级上册数学教学课件 第1章 有理数 1.2 数轴、相反数与绝对值 1.2.2 相反数.pptx
- 2024年新人教版一年级上册数学教学课件 5 6~10的认识和加减法 练习十五.pptx
- 2024年新人教版七年级上册语文教学课件 第5单元18《我的白鸽》课时2.pptx
- 2024年新人教版七年级数学上册教学课件 第二章 有理数的运算 2.1.2有理数的减法(第2课时).pptx
- 2024年新人教版七年级数学上册教学课件 第二章 有理数的运算 2.3.1有理数的乘方(第1课时).pptx
- 2024年新人教版七年级上册语文教学课件 第4单元 专题学习活动:少年正是读书时.pptx
- 2024年新人教版一年级上册数学教学课件 5 6~10的认识和加减法 第7课时 8和9的组成.pptx
- 2024年新湘教版七年级上册地理课件 3.第三章 地球的面貌 1.第一节 世界的海陆分布 .pptx
- 2024年新湘教版七年级上册数学教学课件 第1章 有理数 1.5 有理数的乘法和除法 1.5.3 有理数的乘除.pptx
文档评论(0)