基因工程重点.doc

一、基因工程 在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接、然后插入到载体分子中，转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖并表达出基因产物。 过程:1目的基因的获取2基因表达载体构建3将目的基因导入受体细胞4目的基因的检测与表达5含目的基因的细胞培养，发酵及基因产物的分离纯化。 应用:1.基因治疗、基因诊断2.多肽药物、疫苗、抗体3.转基因动物（畜牧业、渔业生物反应器）4.转基因植物（农业、林业生物反应器）5.冶金、环保、轻工、食品。 要素:目的基因、载体、工具酶、受体细胞。 抗虫棉:1苏云金芽孢杆菌（提取）2抗虫基因（形成）3重组DNA（导入）4棉花细胞5抗虫棉（有毒蛋白）6表达蛋白的鉴定。 理论基础:理论上的三大发现:1.1944年肺炎双球菌转化实验证明了DNA是遗传物质2.1962年DNA的双螺旋结构和半保留复制机理，解决了基因的自我复制和传递问题3.“中心法则”和操纵子学说，并成功的破译了遗传密码，阐明了信息的流向和表达问题。技术上三大发明:1工具酶的发现和应用2载体的发现及其应用3重组子导入受体细胞。 二、工具酶 1.限制性核酸内切酶:是一类能识别双链DNA上特殊核苷酸的序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶，且有降解和切除无关外源基因的作用。 类型:I类:能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近切割双链，但切割序列没有专一性；II类：识别位点（回文序列）严格专一，并在识别位点内将双链切断；III类：识别位点严格专一（不是回文序列），但切点不专一，往往不在识别位点内部。 基本特征:1识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链2主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵3细菌的限制与修饰作用。 影响活性因素：1酶的纯度2.DNA样品的纯度3.DNA的甲基化程度4酶切反应的温度与时间5.DNA分子的构型6限制性核酸内切酶的反应缓冲液。 星号活性:在非理想的条件下,内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列,这一现象称星号活性。用*表示。诱发因素:1.高甘油含量2.限制性内切核酸酶用量过高3.低离子强度4.高pH(8.0以上)5.含有有机溶剂，如DMSO、乙醇等6.有非Mg2+的二价阳离子存在(如Mn2+，Cu2+，C02+，Zn2+等)。 R/M体系(限制与修饰系统):寄主是由两种酶活性配合完成的，一种是修饰的甲基转移酶，另一种是核酸内切限制酶。作用:1保护自身的DNA不受限制；2破坏外源DNA使之迅速降解。 2.DNA连接酶：催化DNA中相邻的5磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接。 影响连接效率因素：温度（通常在4-15℃ ）；ATP的浓度(10μM／L–1mM／L )；连接酶浓度（一般平末端大约需1～2U，黏性末端仅需0.1U）；反应时间（通常连接过夜）。温度越高，时间越短，温度越低，时间越长。 作用特点:两条链必须分别具有自由3’－OH和5’－P，而且这两个基团彼此相邻；耗能过程。 作用机理:1.ATP（NAD+)提供激活的AMP；2.ATP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi；3.AMP与连接酶的赖氨酸e-氨基相连；4.AMP随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA一条链的5端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物；5.3’-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。 3.DNA聚合酶Ⅰ:合成双链cDNA分子或片段连接；缺口平移制作高比活探针；DNA序列分析；填补3末端。 4.Klenow DNA 聚合酶:为单链多肽，有两种活性：5→3核酸外切酶活性；3→5核酸外切酶活性。 用途（利用5’→3’的聚合酶活性）:1修补限制性酶消化DNA形成的3隐蔽末端；2标记DNA片段的3末端；3.cDNA克隆中第二链cDNA的合成；4.DNA序列的测定。 5.逆转录酶:一种依赖RNA的DNA聚合酶，它有 5→3’合成 DNA 活性，但是无3→5’外切活性。 碱性磷酸酶:切除末端（5’）磷酸基，防自连。 反转录酶:合成cDNA 替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析。 多聚核苷酸激酶:催化多聚核苷酸5′羟基末端磷酸化，或标记探针。 末端转移酶:在3羟基末端进行同质多聚物加尾。 Pfu DNA 聚合酶:来自激烈热球菌，具有理想的扩增保真度，具有极高的热稳定性，是目前使用最广泛的具有3→5外切活性的 PCR 酶。 三、载体 功能:运送外源基因高效转入受体细胞；为外源基因提供复制能力或整合能力；为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。 特点：1至少有一个复制起点2至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞3具备多克隆位点（MCS），便于外源基因插入4自身分子量较小，拷贝数高5